178件染发类化妆品细菌回复突变试验结果分析

江 漪，吴剑辉，朱素珍，李培宁，刘香梅*

(广州质量监督检测研究院，广东 广州511447)

染发类化妆品属于特殊化妆品，需经国务院药品监督管理部门注册后方可生产、进口。按化妆品注册和备案检验项目要求，氧化型染发产品需进行细菌回复突变试验(或体外哺乳动物细胞基因突变试验)和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验检测致突变性。

2021年，全国药品监督管理部门对染发类、洗发护发类、彩妆类、防晒类等11类化妆品抽检，其中染发类产品合格率最低，为87.6%，其他类产品合格率均达到96%以上[1]。说明在不同种类的化妆品中，染发类产品存在较高的安全风险，需要监管部门重视。2018—2020年通告的染发类不合格样品中，不合格原因主要是染发剂检验结果与配方或标签标识的染发剂成分不符、超限量使用染发剂或添加禁用染发剂[2-3]。染料组分实测值与配方值不相符、甚至实测值超限值，提示染发剂存在较高的质量与安全隐患。氧化型染发剂中的染料前体、偶合剂等成分具有不同程度的致癌、致敏和遗传毒性[4]。本文旨在根据2021年广州质量监督检测研究院检测的178件染发类化妆品细菌回复突变试验结果，确定检出致突变阳性较多的菌株和剂量，分析染发类化妆品的致突变原因，探索染发类化妆品的安全风险因素。

1 材料与方法

1.1 材料

178件染发类化妆品为2021年企业送广州质量监督检测研究院检测的产品，涵盖33个品牌。试验前按产品使用说明书将1剂染发膏和2剂双氧奶按比例混合均匀后，用灭菌水配制12.5、25、50、100、200 mg/mL的受试物溶液备用。预设染发剂的最高剂量为20 mg/皿(+S9)、10 mg/皿(-S9)，以下按2倍梯度分别设3个剂量组。根据抑菌情况和受试物沉淀情况，调整剂量。

1.2 试验菌株

鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，购自美国MOLTOX公司。试验前，5种菌株均经过本实验室鉴定，菌株的生物特性符合试验要求。

1.3 主要试剂

叠氮钠和2-氨基芴购于美国Sigma Aldrich公司，敌克松购于美国ChemService公司，1,8-二羟基蒽醌购于阿拉丁试剂有限公司，2-氨基蒽购于日本TCI公司，S9购于江苏齐氏生物科技有限公司，辅酶Ⅱ购于上海源叶生物科技有限公司，6-磷酸葡萄糖购于阿拉丁试剂有限公司。

1.4 代谢物活化系统

S9加相应的辅助因子(6-磷酸葡萄糖、辅酶Ⅱ)配制成含10% S9的混合液(S9mix)，作为体外代谢活化系统。临用时配制，保存于冰浴中，备用。

1.5 主要仪器

全自动Ames试验仪购于北京慧荣和科技有限公司；菌落计数仪购于杭州迅数科技有限公司；HVE-50高压蒸汽灭菌器购于日本Hirayama公司；SHEL LAB生化培养箱购于美国SHEL LAB公司；SBS40振荡水浴购于英国BIBBY STUART公司。

1.6 方法

依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)[5]细菌回复突变试验，检测178件染发类化妆品的致突变性。

1.6.1 增菌培养分别于TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535主平板取生长良好的单个菌落接种于营养肉汤培养基中，混匀，37℃振荡(100 r/min)培养10 h。

1.6.2 平板掺入法采用全自动Ames试验仪，将顶层琼脂培养基2.0 mL加入试管中，然后每管依次加入0.1 mL受试物溶液、0.1 mL试验菌株增菌液和0.5 mL磷酸盐缓冲液或者0.5 mL S9混合液(需代谢活化时)，充分混匀，迅速倾入底层培养基平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里培养48 h，记录每皿回变菌落数。

试验在加和不加S9混合液的条件下进行，除设受试物各剂量组外，同时设空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组和无菌对照组。每个剂量均做3个平行平板。

1.6.3 数据处理计算各菌株各剂量3个平板回变菌落数的均值和标准差。

1.6.4 结果评价受试物诱发的TA97a、TA98、TA100、TA102回变菌落数是溶剂对照组的2倍或2倍以上，受试物诱发的TA1535的回变菌落数是溶剂对照组的3倍或3倍以上，并出现以下情形之一，则该染发剂判定为致突变阳性：①呈剂量-反应关系；②任何一个剂量条件下，出现阳性反应并有可重复性。染发剂经上述5个试验菌株测定后，只要有1个试验菌株，无论在加S9或不加S9条件下为阳性，均可报告该染发剂细菌回复突变试验为致突变阳性。如果染发剂经5个试验菌株检测后，无论加S9和不加S9均为阴性，则可报告该染发剂为致突变阴性。

1.6.5 数据分析录入染发类化妆品信息(名称、品牌、加或不加S9、最高剂量、阳性菌株、阳性剂量)，采用Microsoft Excel进行数据整理分析。

2 结果

2.1 178件染发类化妆品细菌回复突变试验的最高剂量

178件染发类化妆品中，在加S9条件下，无细菌毒性、最高剂量为20 mg/皿的有99件，占比55.62%，平皿中无抑菌、沉淀轻微可见。有细菌毒性、最高剂量为10 mg/皿的有72件，占比40.45%。在不加S9条件下，20 mg/皿会产生细菌毒性，最高的剂量为10 mg/皿，占比9.55%；最高剂量5 mg/皿占比最高，为60.67%，有108件。最高剂量的分布情况见表1。

表1 178件染发类化妆品细菌回复突变试验最高剂量的分布

2.2 178件染发类化妆品细菌回复突变试验的阳性率

178件染发类化妆品中，在加S9的条件下，细菌回复突变试验阳性的样品数为35件，这35件中的7件，不加S9的条件下，致突变性亦为阳性。剩下的143件染发类化妆品，在加S9和不加S9条件下均为致突变阴性。因此，178件染发类化妆品中致突变阳性的有35件，阳性率为19.67%。

2.3 5种试验菌株测定细菌回复突变试验的阳性结果

35件致突变阳性的染发类化妆品中，5个菌株的阳性检出数量分别为：TA98 35件，TA97a 15件，TA100 2件，TA102 0件，TA1535 2件。TA97a、TA100、TA1535致突变性阳性的样品，TA98致突变性也为阳性。

2.4 5种试验菌株阳性结果的剂量分布情况

致突变阳性的染发类化妆品，随着剂量的升高，回变菌落数升高，阳性反应出现在高剂量组。35件致突变阳性的染发类化妆品中，加S9的条件下，TA97a出现阳性反应最多的剂量为10 mg/皿，TA98出现阳性反应最多的剂量为5 mg/皿；不加S9的条件下，TA98出现阳性反应最多的剂量为2.5 mg/皿。结果见表2。

表2 35件细菌回复突变试验阳性的染发类化妆品阳性剂量分布(件)

2.5 不同品牌细菌回复突变试验致突变阳性结果的分布情况

33个品牌178件染发类化妆品的阳性检出结果如表3。不同品牌染发类化妆品细菌回复突变试验阳性检出率差异较大，最低的为0，最高的达60%。

表3 不同品牌染发类化妆品细菌回复突变试验阳性结果分布

3 讨论

染发剂最高剂量由溶解度和细菌毒性决定，178件染发类化妆品细菌回复突变试验最高剂量的结果显示，在加S9的条件下，96.07%的染发类化妆品最高剂量为20或10 mg/皿；在不加S9的条件下，60.67%的染发类化妆品最高剂量为5 mg/皿。此数据可为染发剂的剂量设计提供参考。加S9后，染发类化妆品细菌毒性降低，说明S9中的生物转化酶作用染发类化妆品后对细菌产生减毒作用。

178件染发类化妆品细菌回复突变试验致突变阳性率为19.67%(35件)，且均在加S9下致突变阳性，说明染发类化妆品中具有致突变性的多为需要代谢活化的染料组分。在35件致突变阳性的染发类化妆品中，TA98、TA97a的阳性检出数量较高，阳性剂量多出现在10和5 mg/皿。TA97a和TA98能检测移码突变，说明致突变阳性的染发类化妆品中含有同时导致TA97a、TA98突变的染料组分，且TA98能检测出更多需要代谢活化的致突变物。有研究表明在S9的参与下，经由过氧化氢处理后，染发剂配方中邻苯二胺、对-氯-邻苯二胺、间苯二胺、对-甲氧基-间苯二胺的致突变活性明显增加[6-7]。还有相关研究表示，氧化型染发剂染料前体被过氧化氢氧化后，其氧化产物经代谢活化后对TA98具有较强的回复致突变作用[8]。本次研究结果与该结论一致。

送检的13个品牌(送检染发类化妆品数量不小于5件)致突变阳性检出率差异较大，范围涵盖0～60%，分析可能与染发剂配方中染料前体的含量有较大关联。因此，在染发剂的配方开发中，需加强对着色剂成分含量与组合的研究，在保证染色效果的情况下，提高染发剂的安全性。