臭氧联合紫外线对GMP洁净实验室消毒的效果评价

陈晓燕，钱师宇，曾彩辉，卢建溪

1.中山大学附属第三医院生物治疗中心，广东 广州 510000；2.暨南大学公共卫生学院，广东 广州 510000

环境消毒对于保障药品生产质量管理规范（good manufactursing practice,GMP）层流实验室生物安全，保护实验人员健康，保证实验正常进行至关重要[1]。GMP层流实验室的核心是安全，采取安全、有效消毒灭菌是实验室生物安全的重要保障[2]。GMP层流实验室的空气质量指标物主要是尘埃颗粒物（particulate matter,PM）浮游菌，也笼统称之为微生物气溶胶。全球超过20%的呼吸道感染是由微生物气溶胶引起的，微生物气溶胶能引起呼气困难、头晕、头痛等病症，对人体健康具有极大影响[3]。此外，进行细胞体外培养的首要条件是无菌环境，细胞在体外培养对微生物的防御能力匮乏，极易被污染，为其提供无菌的生存和操作环境是顺利进行实验的重要保证[4]。消除环境中的病原微生物、控制室内微生物含量非常重要，除了常用化学消毒液擦拭消毒的表面消毒方法，还有很多空气消毒方式，如臭氧(O3)、紫外线、二氧化氯、过氧化氢、过滤通风、气体 熏蒸、光催化等，其中臭氧和紫外线消毒应用于空气和表面消毒最为广泛[5]。本研究利用臭氧联合紫外线对GMP层流实验室进行消毒，并对消毒效果进行验证观察。报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9 cm血琼脂平板（江门凯林），紫外线杀菌灯（工作压力为220 V、功率＞30 W、辐照强度≥70 μW/cm2），臭氧消毒机。

1.2 试验方法

1.2.1 观察场地 中山大学附属第三医院生物治疗中心，GMP洁净实验室

1.2.2 观察时间2021年1—12月GMP洁净实验室洁净空调运行期间并臭氧联合紫外线消毒，每个月月末布放一次血琼脂平板做沉降菌检测；2022年1月暂停洁净空调和臭氧联合紫外线消毒，更换初、中、高效滤芯两周后布放一次血琼脂平板做沉降菌检测。

1.2.3 消毒 紫外线消毒：2021年1—12月每天两次（中午12∶00-12∶30和晚上12∶00-12∶30），时长30 min。臭氧消毒：2021年1—12月每周3次（一、三、五晚上12∶00-凌晨1∶30），时长90 min。

1.2.4 采样 用直径9 cm血琼脂平板，在室内应用自然沉降法进行采样，平板采样的位置为室内距墙1 m处四角，距地面1 m处。本中心GMP洁净实验室分为正压洁净室和负压洁净室，正压洁净室共计14个采样布防点：一更、二更、缓冲室1、缓冲室2、缓冲室3、脱衣室、洁具室1、洁具室2、细胞培养室二、细胞培养室三、暂存室、储存室、洁净走廊二、洁净走廊三；负压洁净室共计8个采样布防点：一更、二更、缓冲室1、缓冲室2、缓冲室3、细胞培养室一、脱衣室、废物处理室。其中细胞培养室因面积较大，需布放5个血平板，室内距墙1 m处四角和室内正中央。其他室各布放两个血平板，共采集53份样品。采样时将平皿打开扣放在平板旁，暴露5 min，盖好立即将平板置于37℃保温箱培养48 h，计数每平板上菌落数，≤3 CFU/平板判定合格。

采样方法和监测评价标准依据1998版药品生产质量管理规范。

1.3 统计方法

采用Excel和Prism6对数据进行录入、整理和绘制。

2 结果

2021年臭氧联合紫外线对GMP层流实验室连续消毒运行12个月，每个月月末布放一次血琼脂平板做沉降菌检测，经过12个周期重复试验结果显示（见表1），布放在负压洁净室的8个采样点均未检测到沉降菌落。布放在正压洁净室的14个采样点，在2、8、9、12月个别采样点可见1～2 CFU/平板。其中2月份，缓冲室2的平均菌落数为1 CFU/平板；细胞培养室二的平均菌落数为0.4 CFU/平板；洁净走廊二的平均菌落数为0.4 CFU/平板。而8月份的细胞培养室二的平均菌落数为0.2 CFU/平板。9月份二更的平均菌落数为0.5；缓冲室1 CFU/平板的平均菌落数为0.5 CFU/平板。12月份的一更的平均菌落为1.5 CFU/平板；缓冲室3的平均菌落数为1 CFU/平板；脱衣室的平均菌落数为1 CFU/平板；洁具室2的平均菌落数为0.5 CFU/平板。可见菌落皆≤3 CFU/平板（见图1），判定合格，每月采集的53份样本合格率均为100%。

而2022年1月暂停洁净空调和臭氧联合紫外线消毒，更换初、中、高效滤芯两周后布放一次血琼脂平板做沉降菌检测，此次布放除了正压洁净室的暂存室和洁净走廊二、负压的二更无菌落，其他各采样点都可见菌落生长。其中，负压洁净室的缓冲室3平均菌落数为4 CFU/平板，负压洁净室的脱衣室平均菌落数为3.5 CFU/平板（见表1），可见菌落皆＞3 CFU/平板（见图1），判定为不合格，此次布放采样合格率为90%。

图1 GMP洁净实验室各采样点菌落数

表1 臭氧联合紫外线对GMP洁净实验室每个月消毒效果（CFU/平板）

续表1

3 讨论

GMP在国际上已成为药品生产和质量管理的基本准则，是一套系统的、科学的管理制度，药品不仅要符合质量标准，而且其生产全过程必须符合GMP规定[6]。GMP规范定义了ABCD 4个洁净度等级，对于不同洁净度等级，要求空气中含有的悬浮粒子、微生物数量都是严格规定不同的上限数值，本实验室根据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》规定设立GMP层流实验室，属于A+B级实验室，环境要求B级[7-8]。通过对空调、送排风系统、工作区与缓冲间的压差严格要求，以及定时定点进行消毒灭菌，保证空气洁净度，达到GMP基本要求[9]。

紫外线是一种低能量电磁辐射，照射菌体后引起原生质变化或死亡达到消毒灭菌的作用[9]，紫外线是临床常用的绿色、成本低的空气消毒方法。但紫外线的照射能量仅有5 ev，穿透性差，消毒有死角、杀菌持效短，其效果还受到照射时间、消毒距离、温度、湿度、灯管清洁等多方面因素的影响，因此其在临床中的应用受到限制[10]。臭氧是一种强氧化剂和催化剂，能氧化分解细菌内部葡萄糖所需的酶，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，破坏细菌新陈代谢，使细菌发生畸变、灭活死亡[10]。其对细菌繁殖体、病毒、芽孢、真菌等多种微生物，具有较强的除霉、除臭功能，杀菌起效快、持久，杀菌彻底无死角、无残留污染，同时更广谱，但臭氧稳定性差，具有一定毒性[11]。两者联合使用，既利用紫外线消毒简便、价格便宜可多次消毒，保证每次实验后都可以达到及时消毒灭菌，又利用臭氧广谱杀菌、杀菌无死角等特点，提高实验室空气消毒的效率和质量[12]。本研究于2021年1—12月GMP洁净实验室洁净空调运行期间，采用臭氧联合紫外线消毒，于每天上、下午实验结束，人员离开后于中午和晚上采用紫外线消毒30 min，同时每周3次每两天晚上臭氧消毒90 min，对GMP层流实验室空气和实验台面、桌椅、器皿等表面进行彻底消毒。消毒效果评价是通过在月末定时定点布放血琼脂平板进行沉降菌检测验证消毒灭菌效果，结果显示，布放在负压洁净室的8个采样点未见菌落，布放在正压洁净室的14个采样点偶见菌落，但可见菌落皆≤3 CFU/平板，判定合格，合格率均达到100%，表明臭氧联合紫外线消毒可有效满足消毒要求。2022年1月GMP洁净实验室洁净空调停止运行、消毒，更换初、中、高效过滤器两周后，布放血琼脂平板做沉降菌检测，布放在负压洁净室的2个采样点可见菌落＞3 CFU/平板。虽然，GMP洁净实验室由于更换滤芯和空调维护暂停两周，期间有工人进出实验室，但由于实验室长期臭氧联合紫外线消毒，实验室仍然相对洁净，仅有两个采样点可见菌落超标，此次布放采样合格率为90%，可见臭氧联合紫外线消毒功效的持久性[13]。

综上所述，臭氧联合紫外线消毒，操作简单，消毒灭菌更彻底，而且避免了因扰动所产生的二次污染，对GMP层流实验室具有很好的消毒作用，建议在实验室空气消毒中广泛使用。