基于MLPA技术筛选帕金森病遗传相关基因及其与中医证型分布的关系和临床诊断价值

2022-10-09施宗生刘大同孙培养

分子诊断与治疗杂志 2022年9期

施宗生刘大同孙培养

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中常见的一种神经退行性变性疾病，主要的临床表现为运动迟缓、静止性震颤、姿势步态障碍、肌强直等，同时常伴有抑郁、睡眠障碍、便秘等症状［1］。在中医理论中，PD 属于“颤证”的范畴［2］。据统计，PD 全球流行率约占总人口的0.3%。60 岁以上发病率约为1%，并随着年龄的增长而急剧增加，其中80 岁以上者占3%［3］。然而，目前对于PD的诊断标准仍然只有基于运动症状的鉴定，但是在长时间发生神经退行性病变时，临床的诊断受到个体发病特征及疾病严重程度不同的影响，造成诊断结果出现差异［4］，因此体液生物标志物在临床确诊PD 具有重要意义。基因检测可以明确病因，有助于诊断和鉴别诊断PD。PARKIN基因和α-突触核蛋白（α-Synuclein，SNCA）基因等须应用多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）和其他技术来完成基因拷贝数检测［5］。本研究对106 例PD 患者进行MLPA 检测，筛选相关遗传基因，并对其与中医证型分布的关系与其诊断效能进行分析。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年12月庐江县中医院确诊的106 例PD 患者作为研究对象，记为PD组，同时选取同期年龄、性别等与PD 组相匹配的体检健康志愿者50 名作为对照组。PD 组纳入标准：①符合《帕金森病抑郁中西医结合诊断与治疗专家共识（2021年版）》［6］中关于帕金森病者诊断标准，并确诊；②年龄≥18 岁；③患者本人或家属均对本研究知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①伴有严重的肝、肾等器官功能障碍；②免疫功能障碍、缺陷等；③伴有严重的贫血、营养不良等；④存在颅外伤史、脑血管病史；⑤合并精神疾病等。对照组纳入标准：为自愿者，无PD 家族史、无PD 症状。PD 组男76 例，女30 例，年龄47～81 岁，平均年龄（61.47±8.63）岁，病程1～9年，平均（5.14±2.22）年，合并疾病：高血压46 例、糖尿病13例，高血脂7 例。对照组男29 名，女21 名，年龄41～80 岁，平均年龄（62.44±3.14）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具可比性，本研究已通过本院伦理委员会批注。

1.2 方法

抽取所有受试者外周静脉血2～3 mL，送至杭州迪安医学检验中心有限公司，采用MLPA 技术对帕金森相关基因包括SNCA、PARKIN、PINK1、PARK7、UCHLL、LRRK2、GCH1、ATP13A2基因等各外显子是否存在变异。根据结果，采用荧光定量（qRT）-PCR 对相应的mRNA 表达水平进行检测。

1.3 观察指标

比较两组相关基因mRNA 表达水平，及相关基因与中医证型分布的关系，并绘制ROC 曲线检验其对帕金森的临床诊断效能。

中医症候诊断标准：依据《中医老年颤证诊断和疗效评定标准（试行）》［7］中的证型分类标准，配合应用中医四诊，可将PD 分为痰热动风证、血瘀动风证、气血两虚证、肝肾不足证和阴阳两虚证。

1.4 统计学方法

本研究数据采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。计量资料用（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用n（%）表示，组间比较用χ2检验；绘制ROC曲线检验诊断效能；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLPA 技术帕金森病遗传相关基因筛选结果

纳入106 例PD 患者，通过MLPA 技术检出36例（33.96%）PARKIN基因3 号、4 号外显子缺失突变，14 例（13.21%）ARKIN基因2 号外显子点突变，67 例（63.21%）α-突触核蛋白（SNCA）基因1 号外显子重复突变，其中15 例（14.15%）患者未检出明确致病位点。

2.2 PARKIN、SNCA 基因突变情况及其与中医证型分布的关系

PD 患者不同的基因突变在证型的分布上差异有统计学意义（P＜0.05），PARKIN基因突变以肝肾不足证为主，占50.00%；而SNCA基因突变以血瘀动风证为主，占52.24%。见表1。

表1 PARKIN、SNCA 基因突变情况及其与中医证型分布的关系［n（%）］Table 1 PARKIN and SNCA gene mutations and their relationship with TCM syndrome type distribution［n（%）］

2.3 两组PARKIN、SNCA mRNA 表达水平比较

PD 组外周静脉血PARKINmRNA 表达水平低于对照组、SNCAmRNA 表达水平高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组PARKIN、SNCA mRNA 表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of PARKIN and SNCA mRNA expression levels between the two groups（±s）

组别PD 组对照组t 值P 值n 106 50 PARKIN mRNA 0.91±0.11 1.02±0.16 5.007 0.000 SNCA mRNA 1.00±0.15 0.86±0.09 5.781 0.000

2.4 PARKIN、SNCA mRNA 表达对PD 的临床诊断价值

绘制PARKIN、SNCAmRNA 诊断PD 的ROC曲线，结果如下，PARKIN、SNCAmRNA 及两针联合对PD 诊断ROC 曲线下面积（AUC）分别为0.727、0.859、0905（P均＜0.05），敏感度分别为0.745、0.632、0.745，特异性分别为0.700、0.920、0.900；两者联合诊断效能优于PARKIN或SNCAmRNA 单项诊断。见表3、图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表3 PARKIN、SNCA mRNA 诊断PD 的ROC 曲线结果Table 3 ROC curve results of PARKIN and SNCA mRNA for PD diagnosis

3 讨论

本研究中，依据相关评定标准并配合应用中医四诊，将PD 分为痰热动风证、血瘀动风证、气血两虚证、肝肾不足证和阴阳两虚证。本研究采用MLPA 技术对PD 遗传基因进行筛选，并分析其与中医证型分布的关系和临床诊断价值，为临床的诊断与治疗提供参考。

MLPA 技术检测结果显示，纳入106 例PD 患者中检出36 例（33.96%）PARKIN基因3 号、4 号外显子缺失突变，14 例（13.21%），PARKIN基因2 号外显子点突变，67 例（63.21%）α-突触核蛋白（SNCA）基因1 号外显子重复突变，其中15 例（14.15%）患者未检出明确致病位点。根据相关研究报道，PD 的病理改变，可能是由SNCA 蛋白聚集小体造成的，SNCA 蛋白的分解代谢受损促进了其有毒低聚物的形成，而SNCA基因则被认为是PD 的一个致病基因［8］。SNCA基因的基因突变，及其多态性可能使SNCA 蛋白个过高表达，造成α-sunuclein 蛋白的异常聚集，从而导致患者神经功能障碍和神经元死亡［9］。有研究发现线粒体质量控制过程被确定为PD 关键参与者，PARKIN基因的缺失突变导致通过称为线粒体自噬对功能失调的线粒体去除不足［10］。同时有研究通过体外细胞培养试验，PARKIN 蛋白可通过抑制线粒体的凋亡，降低α-sunuclein 蛋白表达，从而起到保护神经元的作用，降低PD 的发生［11］。同时，本研究对患者外周血中PARKIN与SNCAmRNA 表达水平进行检查，结果显示，PD 患者中PARKINmRNA表达水平显著降低、SNCAmRNA 表达水平显著升高，结果与研究［12］一致。

PD 在我国传统医学理论中归于“颤证”、“震颤”等范畴，于近现代，在中医经典的基础上，一些丰富经验的中医结合多年临床经验，总结了颤证的病因、病机，刘翠芳等［13］总结为肝肾不足、气血亏虚、血瘀等；许玉珉等［14］认为颤证病机在肾虚兼血瘀。本研究对PARKIN基因、SNCA基因的突变情况与PD 中医证型分布关系进行分析，结果显示PD 患者不同的基因突变在证型的总体分布上存在差异，PARKIN基因突变以肝肾不足证为主，占50.00%；而SNCA基因突变以血瘀动风证为主，占52.24%。有研究表明，PARKIN可激活线粒体的自噬，而PARKIN基因缺失，PARKIN 蛋白表达降低，线粒体受损、细胞凋亡增加，造成肝肾功能损伤［15］。PD 中SNCA基因的重复突变，导致α-sunuclein 蛋白异常聚集从而引起神经系统变性，其宏观表现为血瘀等病理产物的形成［16］。同时本研究对PARKINmRNA 与SNCAmRNA 表达水平对PD 临床诊断效能进行分析，结果表明，二者均具有良好的诊断效能，而两者联合诊断价值更高。然而，经过研究表明，PARKIN基因的突变多出现在早发型PD 中，且随着年龄的增长，该基因位点突变率对着降低。因此仍需扩大样本量，对不同地区、环境的患者，增加相关基因的检测，旨在得到更客观、准确的数据。

综上所述，PD 患者PARKIN基因、SNCA基因存在突变，且其与中医证型分布存在密切关系，绘制ROC 曲线分析，PARKINmRNA 与SNCAmRNA表达水平对PD 具有一定的临床诊断价值，为PD的前期诊断及治疗提供参考。