乳酸链球菌素Q13的纯化及其对保加利亚乳杆菌的抑菌机理

万 倩，黄晓英，李启明，吴华星，刘绒梅，唐俊妮,*

（1.西南民族大学食品科学与技术学院，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；2.乳品营养与功能四川省重点实验室，新希望乳业股份有限公司，四川省优质乳品制备与质量控制技术工程实验室，四川 成都 610000）

酸奶是指以原料乳为发酵底物，并以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为主要菌种发酵而成的乳制品，因其具有营养丰富、风味独特等优点而广受消费者的喜爱。然而，酸奶在贮存、运输及销售环节中并不能保证完全的冷链条件，即容易出现脱冷现象，进而使得乳酸菌继续发酵残存乳糖产生乳酸，乳酸的大量积累造成酸奶感官质量严重降低，缩短酸奶的保质期，限制酸奶产品的跨地域销售。有研究报道酸奶后酸化会损害益生菌的生存能力，这也是大多数酸奶产品活菌数含量低的主要原因。大量研究表明酸奶后酸化的主要原因是保加利亚乳杆菌在后期继续发酵代谢乳糖产生乳酸所造成。Laye等研究发现保加利亚乳杆菌生长代谢过程中可以产生-乳酸和-乳酸，而导致酸奶后酸化的主要物质是保加利亚乳杆菌产生的-乳酸。如何通过绿色安全有效以及低成本的方式控制酸奶在储运、销售环节中的后酸化已经成为目前奶制品行业学者研究的热点。

细菌素是核糖体上合成一类多肽或抗菌蛋白，其抑菌范围的宽窄具有菌株特异性，并且多数细菌素是由乳酸菌这一种属所产生。长期以来，乳酸菌以其公认安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物的地位在世界范围内被广泛应用于食品发酵。因此，乳酸菌细菌素被认为是一种绿色、安全以及高效的天然抑菌物质，并且由乳酸乳球菌乳酸亚种所产生乳酸链球菌素是目前唯一通过美国食品药品监督管理局/世界卫生组织认证的细菌素。有研究人员发现乳酸链球菌素不仅可以使肉类产品免受致病菌污染，提高安全性和延长货架期，还能有效抑制酸奶产品发酵后期保加利亚乳杆菌的生长，从而达到缓解酸奶后酸化效果。

本实验基于前期筛选所得到的1 株拮抗保加利亚乳杆菌生长的乳酸乳球菌Q13，通过对其所产生的乳酸链球菌素进行硫酸铵沉淀、超滤及葡聚糖凝胶层析等纯化，研究乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞膜通透性、胞内酶活性及菌体细胞结构等影响，阐明乳酸链球菌素对保加利亚乳杆菌抑菌作用机制，为开发延缓酸奶后酸化的新型安全有效辅助添加剂提供理论数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸乳球菌Q13（Q13）由新希望乳业股份有限公司乳品营养与功能四川省重点实验室提供，并以从后酸化较为严重的酸奶产品中分离鉴定的保加利亚乳杆菌LMG-1（LMG-1）作为指示菌。

MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培养基 广东环凯微生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；超滤管15 mL（3、10 kDa）、普通层析柱（10 mm×60 cm）、宽范围彩色预染蛋白质Marker（11～245 kDa）、二乙酸荧光素北京索莱宝科技有限公司；硫酸铵、葡聚糖凝胶G-50上海源叶生物科技有限公司；超微量Na/K-ATP酶试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5804/5804 R高速台式离心机 德国Eppendorf公司；DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司；ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统/全能型成像仪 美国Bio-Rad公司；JY92-IIN超声细胞破碎仪宁波新芝生物科技有限公司；318C+酶标仪 上海沛欧分析仪器有限公司；INC821C两槽式恒温培养箱雅马拓科技贸易上海有限公司；AKHL-III-24艾柯超纯水机成都康宁实验专用纯水设备公司；MLS-3020电热自动灭菌锅 日本SANYO公司；BBS-DDC医用洁净工作台济南鑫贝西生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸乳球菌Q13发酵上清液的制备

发酵培养基：称取79 g乳清蛋白粉、21 g大豆蛋白胨，加入蒸馏水或去离子水1 L，边加热边搅拌至完全溶解，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

将菌株Q13接种于上述培养基，30 ℃恒温静置培养24 h，将发酵液于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，调pH值至中性后，再用0.22 μm水系滤器过滤得无菌上清液，冷藏备用。

1.3.2 硫酸铵沉淀

取1.3.1节制备的无菌上清液，等体积分配至离心管中，再分别向各管中缓慢添加硫酸铵并温和搅拌，使其饱和度分别为20%、40%、60%、80%和100%，置于4 ℃静置过夜，离心获沉淀并回溶至原体积的1/10。使用平板打孔法检测不同硫酸铵饱和度下沉淀回溶液的抑菌效果，并利用BCA蛋白定量试剂盒测定回溶液中蛋白含量，建立硫酸铵盐析曲线，确定后续实验所需硫酸铵饱和度。

1.3.3 超滤

在冰浴条件下向Q13无菌上清液中缓慢加入硫酸铵至终饱和度为60%，待硫酸铵颗粒完全溶解后，于冰箱静置过夜，离心获沉淀并用1/10原体积量的超纯水回溶，使用0.22 μm水系滤膜过滤得无菌回溶液，并用截留分子质量为3 kDa和10 kDa的超滤离心管（5 500 r/min，30 min）处理无菌回溶液，分别获得＜3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa三个组分并将其记为A、B、C，测定A、B、C三个组分的抑菌活性。选择A、B、C三个组分抑菌效果最为明显的进行后续实验。

1.3.4 Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析

参照Perumal等方法略作修改，主要包括制备Sephadex G-50凝胶、装柱、加样等过程，并利用无菌超纯水进行洗脱，收集各段洗脱峰，检测洗脱液OD，并利用平板打孔法测定各洗脱峰的抑菌圈直径。对有抑菌效果的洗脱峰收集后进行冷冻干燥浓缩，以供后续实验。

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

利用SDS-PAGE检验乳酸链球菌素Q13纯化效果和确定该细菌素分子质量，选用15%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE的配制。并采用分子质量范围为11～245 kDa的Marker作为分子质量标准参照。

1.3.6 乳酸链球菌素Q13最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定

参照孙悦等的方法略作修改，将乳酸链球菌素Q13加入MRS肉汤培养基中，采用二倍稀释法使其终质量浓度分别为25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.20、0.10 mg/mL，按3%接种量接入保加利亚乳杆菌LMG-1，37 ℃静置培养24 h，通过肉眼观察到无浑浊现象所对应质量浓度即为乳酸链球菌素Q13的MIC。以未经过乳酸链球菌素Q13处理的LMG-1菌株作为对照组。

1.3.7 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌生长曲线的影响

取经过2 次活化的菌株LMG-1，按3%接种量接入含有不同质量浓度（1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、0 MIC）乳酸链球菌素的MRS肉汤中，37 ℃培养24 h，每隔1 h取样测定OD，以培养时间（h）为横坐标、OD为纵坐标，绘制保加利亚乳杆菌生长曲线。对照组（0 MIC）除未添加乳酸链球菌素Q13以外，其他操作与处理组相同。

1.3.8 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌胞内酶活性的影响

根据梅佳林等方法略作修改，将指示菌LMG-1活化2 代（对数期）后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min获菌体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中（原培养液体积），加入乳酸链球菌素Q13使其终浓度分别为4 MIC、2 MIC和1 MIC。37 ℃恒温培养6 h，离心弃去上清液收集菌体细胞重悬于PBS，冰水浴超声破碎菌体细胞，每次超声时间设置为2 s，间隔时间设置为4 s，总时间为1 min。利用AKP检测试剂盒（OD）和超微量Na/K-ATP酶试剂盒检测胞内酶活性（OD）。对照组设置同1.3.7节。

1.3.9 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞膜通透性的影响

将指示菌LMG-1活化2 代（对数期）后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃掉上清液将沉淀用PBS重悬至原培养液体积，加入乳酸链球菌素Q13使其质量浓度分别为4 MIC、2 MIC和1 MIC，所有实验组于37 ℃恒温培养12 h，取各实验组菌悬液进行离心收集菌体细胞，使用PBS洗涤菌体2～3 次后弃掉上清液，加入250 μL 2 mg/mL的二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）-丙酮溶液，于室温静置20 min后使用PBS洗涤3～4 次，离心弃上清液后重悬于PBS，用荧光分光光度计检测荧光强度（激发波长297 nm，发射波长527 nm）。对照组设置同1.3.7节。

1.3.10 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞结构的影响

将指示菌LMG-1活化2 代后，离心获菌体细胞，用MRS肉汤培养基回溶至原培养液体积（10CFU/mL），向其中加入乳酸链球菌素Q13使终质量浓度为1 MIC，37 ℃培养12 h后离心收集菌体。后根据扫描电镜样品处理要求制备样品。同时以未经过乳酸链球菌素Q13处理的菌体细胞作为对照组。

1.4 数据分析与处理

资料录入、整理和分析釆用Excel 2019，统计学处理采用SPSS 26.0，使用Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵最适饱和度确定

由不同饱和度硫酸铵沉淀得到的粗提物抑菌活性数据（图1）可知，20%～60%饱和度硫酸铵沉淀后粗提物抑菌效果呈现逐渐增强趋势，当硫酸铵饱和度大于60%时，抑菌效果变化不显著。随着硫酸铵饱和度的增加，粗提物蛋白含量呈逐渐增加的趋势，80%饱和度硫酸铵沉淀后粗提物蛋白含量达到最大值。综合硫酸铵沉淀得到粗提物蛋白含量和抑菌实验结果，抗菌蛋白在60%饱和度下基本已经完全沉淀，当饱和度进一步增加（60%～100%）沉淀的蛋白可能为一些无抑菌活性的杂蛋白。因此选择60%硫酸铵饱和度进行后续实验。

图1 硫酸铵沉淀得到粗提物的蛋白质含量和对LMG-1菌株抑菌效果Fig. 1 Protein contents of crude extract obtained by ammonium sulfate precipitation and its antibacterial effect on LMG-1

2.2 超滤分离结果

将乳酸乳球菌Q13无菌上清液经过60%饱和度硫酸铵沉淀得到的乳酸链球菌素粗提物进行超滤，获得A（＜3 kDa）、B（3～10 kDa）和C（＞10 kDa）3 个组分，由表1可知，仅分子质量大于10 kDa的组分C具有较强抑菌效果，而分子质量小于10 kDa的组分A和B均无抑菌活性，因此选择组分C进行后续分离纯化实验。

表1 不同超滤组分对保加利亚乳杆菌LMG-1的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different ultrafiltration fractions on L. bulgaricus LMG-1

2.3 Sephadex G-50凝胶柱层析结果

乳酸乳球菌Q13无菌上清液经过硫酸铵沉淀和超滤分离后，Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析后共收集到3 个洗脱峰，如图2所示。3 个洗脱峰抑菌实验结果显示，仅有洗脱峰1和2具有抑菌活性，收集合并两峰洗脱液，浓缩至加样体积，以备后续实验。

图2 Sephadex G-50凝胶柱层析结果及洗脱液对保加利亚乳杆菌LMG-1的抑菌活性Fig. 2 Sephadex G-50 gel column chromatographic profile of ultrafiltration fraction C

2.4 乳酸链球菌素Q13纯化物的SDA-PAGE分析

将经过硫酸铵沉淀、超滤和葡聚糖凝胶柱层析等纯化步骤后所得到乳酸链球菌素Q13纯化物进行SDAPAGE，结果见图3。未经纯化乳酸乳球菌Q13无菌上清液呈现出多条蛋白条带（泳道d），经过3 步分离纯化处理后所得到纯化物仅呈现出相对单一条带。同时由图4可初步判断出该乳酸链球菌素分子质量约为17.5 kDa，这与文献所提出的乳酸链球菌素分子质量约为3.5 kDa不一致，Gharsallaoui等报道乳酸链球菌素分子质量一般为3.5 kDa，但该肽能形成二聚体（7 kDa）、四聚体（14 kDa）以及五聚体（17.5 kDa）等多聚体结构。说明本实验所获得乳酸链球菌素分子结构可能为五聚体形式，即乳酸乳球菌Q13所产细菌素是一种新型乳酸链球菌素，将其命名为乳酸链球菌素Q13。

图3 乳酸链球菌素Q13不同纯化物的SDS-PAGE图谱Fig. 3 SDS-PAGE electrophoretogram of of different purified fractions from nisin Q13

图4 纯化乳酸链球菌素Q13的SDS-PAGE图谱Fig. 4 SDS-PAGE electrophoretogram of purified nisin Q13

2.5 乳酸链球菌素Q13 MIC的测定

采用二倍稀释法制备含不同浓度乳酸链球菌素Q13的MRS肉汤培养基，3%接种量接入指示菌LMG-1，37 ℃静置培养24 h后，观察指示菌生长情况见表2，确定乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳菌LMG-1的MIC为0.39 mg/mL。

表2 乳酸链球菌素Q13 MIC测定结果Table 2 MIC of nisin Q13

2.6 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌生长曲线的影响

通过研究细菌生长情况评估抑菌物质对指示菌的抑菌效果，细菌生物量变化通过OD确定，即二者关系为正相关，如图5所示，对照组（0 MIC）细菌生长呈S型曲线，其生长状况良好；加入少量抑菌物质组（1/4 MIC）细菌生长仍呈S型曲线，但生长速度低于对照组，到达稳定期时间延长；而抑菌物质加入量为1/2 MIC时，细菌生长曲线延滞期变长，细菌生长明显受到抑制；抑菌物质加入量增加至1 MIC时，细菌生物量在0～24 h内未发生变化，细菌生长被完全抑制住。

图5 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌LMG-1生长的影响Fig. 5 Effect of nisin Q13 on grwoth curve of L. bulgaricus LMG-1

2.7 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌胞内酶活性的影响

Na/K-ATP酶是存在组织细胞及细胞器的膜上的一种蛋白酶，可通过维持胞外低Na和胞内高K的跨膜离子泵保证细胞环境的稳定性，这对于细胞生长、分化和存活至关重要，通过测定胞内Na/K-ATP酶活性变化情况可以间接反映抑菌物质对指示菌生物膜结构的影响。由图6可知，处理组胞内Na/K-ATP酶活性明显低于对照组，且随着乳酸链球菌素浓度的增加，酶活性下降越明显，表明乳酸链球菌素的处理能有效抑制保加利亚乳杆菌胞内Na/K-ATP酶活性，这可能与指示菌膜结构受损、破坏跨膜离子泵原本维持的稳定状态有关。实验结果与梅佳林等研究芳樟醇处理对莓实假单胞菌胞内Na/K-ATP酶活性影响实验结果相类似，说明胞内Na/K-ATP酶活力的高低是细胞生理代谢活动的关键影响因子之一。

AKP是一种存在于细胞膜与细胞壁之间的蛋白酶，当细胞结构受到破坏时，AKP会外泄至胞外导致胞内AKP含量降低，因此可通过检测AKP活力分析抑菌物质对指示菌细胞结构的破坏情况。由图6可知，对照组胞内AKP活力最高，其次是处理组1 MIC、2 MIC和4 MIC，说明乳酸链球菌素处理可使细胞结构受损，导致胞内酶等组分外泄，这也是导致胞内Na/K-ATP酶和AKP含量降低的主要原因。

图6 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌LMG-1胞内酶的影响Fig. 6 Effect of nisin Q13 on intracellular enzyme activities of L. bulgaricus LMG-1

2.8 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞膜通透性的影响

通过FDA染色实验研究乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞膜通透性，FDA是一种不带电荷、无荧光的脂质性分子，其易通过细胞膜进入胞内被酶水解为荧光素发出绿色荧光，但当细胞膜受到破坏时，形成的荧光素分子流失至胞外导致二乙酸荧光素荧光强度降低。图7显示，对照组（0 MIC）荧光强度为486，处理组（1 MIC、2 MIC、4 MIC）荧光强度分别为271、256和239，可看出乳酸链球菌素处理组荧光强度明显低于对照组，说明乳酸链球菌素的处理改变保加利亚乳杆菌的细胞膜通透性，且乳酸链球菌素浓度越高，FDA荧光强度越低，细胞膜破坏程度越严重。

图7 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌LMG-1二乙酸荧光素荧光强度的影响Fig. 7 Effects of nisin Q13 on fluorescence intensity of FDA stained cells of L. bulgaricus LMG-1

2.9 乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌细胞结构的影响

利用乳酸链球菌素Q13处理12 h后的保加利亚乳杆菌菌体形态如图8所示，对照组菌体形态呈均匀的棒状，形状细长、边缘整齐、表面光滑，细胞形态结构完整；而处理组经乳酸链球菌素Q13处理后，菌体细胞表面褶皱萎缩，形态卷曲变长，细胞外堆积大量细胞碎片。经乳酸链球菌素处理后细胞形态卷曲变长是细胞分裂平面上的细胞膜不稳定延伸所导致，而细胞外细胞碎片的积累可能是细胞内容物通过细胞膜上形成的孔洞流失至胞外。

图8 乳酸链球菌素Q13处理后保加利亚乳杆菌LMG-1的扫描电镜图Fig. 8 SEM observation of L. bulgaricus LMG-1 after nisin Q13 treatment

3 结 论

利用硫酸铵沉淀、超滤和Sephadex G-50凝胶柱层析等方法纯化乳酸链球菌素Q13，结果显示其抗菌蛋白沉淀最适硫酸铵饱和度为60%；硫酸铵沉淀后得到粗提物仅分子质量大于10 kDa表现出抑菌活性；将具有抑菌活性的超滤组分Sephadex G-50凝胶柱层析后得到呈现单一条带的抗菌蛋白，分子质量约为17.5 kDa，结合大量文献推断其可能为乳酸链球菌素的多聚体形式，表明该细菌素是一种新型乳酸链球菌素，将其命名为乳酸链球菌素Q13。同时，还探讨了乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌LMG-1的抑菌机理。结果显示，乳酸链球菌素Q13对保加利亚乳杆菌的抑菌机制主要是通过在靶细胞细胞膜上形成孔洞、增加细胞膜通透性和破坏细胞膜完整性，导致内容物外泄，胞内Na/K-ATP酶和AKP等关键酶含量降低，影响细胞正常能量代谢活动，最终诱导菌体细胞死亡。一方面可以为绿色安全有效的新型乳酸链球菌素开发提供理论数据参考，另一方面，该细菌素有望被作为一种酸奶辅助添加剂应用于乳制品加工业，缓解酸奶后酸化和延长酸奶货架期。

未来还需进一步完善该乳酸链球菌素序列结构和相关动物实验以及如何稳定高效应用等研究内容，以评估其免疫原性、毒性以及在食品领域中应用的重要性。