LncRNA MAGI2-AS3表达对肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响

曾华东 邱娴 涂力 张丹丹 王君丽

根据世卫组织的最新报告，与世界上其他癌症相比，肺癌导致的死亡率最高。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例总数的85%。大量的危险因素归因于肺癌的进展。表皮生长因子受体(EGFR)是最常见的突变驱动基因之一，通过调节PI3K/AKT和MAPK途径，密切参与肺癌的发展[1]。根据美国癌症协会[1]最近的一项研究表明，在2020年最常见的癌症中，肺癌约占12%～13%的新癌症病例，估计造成的死亡人数最多，在男性和女性中分别占23%和22%。据报道，5年生存率低至19%，说明目前缺乏有效的长期治疗[2]。肺癌的危险因素包括吸烟、环境污染、辐射、基因改变等。众所周知，不受控制的增殖是最重要的癌细胞标志之一，并且在恶性肿瘤的癌变和进展中起着至关重要的作用。肺癌发病率与死亡率居高不下，其中非小细胞肺癌占比高达80%以上，包括腺癌、鳞癌及大细胞癌[3]。然而，长期预后已得到改善，中位生存期接近25～30个月，目前约有三分之一的患者存活5年[4]。这可能部分归因于分期的改进，包括使用脑磁共振成像和氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描成像，在放射治疗计划和支持性护理方面的进展[5]。大多肺癌患者确诊时已是晚期，通常采用放化疗等癌症控制方法，但预后较差，且容易复发[6]。在20多年没有临床进展的情况下，在铂类化疗中加入程序性细胞死亡蛋白1轴阻断已经证明了可以延长肺癌患者的生存期，并代表了当前一线治疗的标准。但是耐药性几乎在所有患者中快速增加。

大约98%的人类基因组由非编码DNA组成，这些DNA被转录成大量的非编码RNA (ncRNAs)。通过对哺乳动物转录组的全面研究，人们发现了数以万计的长非编码RNA (lncRNAs)，其长度为200 nt。大量的lncRNA研究表明，这些新的调控元件在人类疾病中高度失调，包括各种类型的癌症。lncRNAs作为支架分子、结构RNA和调控分子，在调控癌症特征的所有方面的信号通路中发挥重要作用[7]。MAGI2-AS3是近年来新发现的lncRNA，其在乳腺癌中发挥重要作用[8]。但其在肺癌中的研究报道较少。本研究通过体内和体外实验探究肺癌的分子机制，为肺癌的临床治疗奠定基础。

资料与方法

一、细胞培养与分组转染

肺癌细胞系PG49购自中国科学院上海生命科学研究所(上海，中国)。细胞在DMEM (Gibco)中培养，添加10% (v/v)胎牛血清；青霉素(终浓度100u/mL)、链霉素(终浓度100mg/mL)，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

将肺癌细胞系接种于60 mm×15 mm的培养皿中(每个平板接种约1.5×105个细胞)，用含有1 mmol/L TCP的DMSO(0.5%)溶液处理24 h或用0.5% DMSO溶液单独处理24 h。24 h后更换培养基，继续培养7天，然后提取总RNA用于RNA分析。

MAGI2-AS3 shRNA和阴性对照shRNA(sh-NC)由上海Gene Pharma公司完成。慢病毒包装采用293T细胞，293T细胞在含有10%FBS的RPMI-1640完全培养基中培养，并每隔一天传代一次。收集病毒，按转染物不同分为：LV-GFP-N转染组(oe-NC，转染空载体)、LV-GFP-MAGI2-AS3转染组(oe-MAGI2-AS3，慢病毒转染MAGI2-AS3过表达)。

待肺癌细胞系处于对数生长期时胰蛋白酶消化、吹打，制成5×104个/mL的细胞悬液并接种于6孔板，每孔2 mL，37 ℃培养过夜。再将病毒(1×108TU/mL)加入细胞中，侵染后48 h，通过荧光显微镜观测GFP表达效率。

二、 qRT-PCR

根据说明书，使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen) 从新鲜冷冻的 HCC 组织或转染细胞中提取总 RNA。SYBR Green PCR Master Mix 用于在 ABI7300 实时 PCR 机器(Applied Biosystems)上进行 qRT-PCR 反应。 热循环条件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 40个循环。以β-actin作为内参照基因。2^(-ΔCT)表示待测基因表达水平，ΔCT=CT(target)-CT(ref)，所用的特异性引物序列(见表1)。

表1 qRT-PCR的引物序列

三、 Western blot检测蛋白表达

BCA 蛋白质测定试剂盒 (Novagen) 用于量化蛋白质浓度。来自每个样品的蛋白质通过 SDS-PAGE 分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜 (Millipore) 中。用牛血清白蛋白封闭后，将所有膜与不同的一抗，在 4℃ 下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。用增强的化学发光检测膜中的蛋白质条带。通过 ImageJ 软件量化条带强度，并将数据标准化为 β-actin。在含有蛋白酶抑制剂的冰冷放射免疫沉淀测定缓冲液(Beyotime)中裂解细胞。在 4℃ 下以12 000 rpm离心20 min后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解物，并使用ECL 检测试剂(Beyotime)转移到聚偏二氟乙烯膜上进行蛋白质印迹分析，并使用 Bio-Rad 凝胶成像系统拍照。

四、 EdU增殖检测实验

在96孔板中转染细胞，培养细胞48 h后，吸去细胞培养液，每孔加入500 μL含EdU(25 μmol/L)培养基孵育2 h。经固定(4%多聚甲醛，30 min)和通透(0.5% TfitonX-100，10 min)处理后，加入500 μL的Apollo®染色反应液(避光)，DAPI染核，最后获取图像并定量分析。

五、 细胞凋亡检测

细胞凋亡/坏死检测试剂盒(Abcam, ab176749)根据说明书使用。将细胞置于含有凋亡细胞Apopxin Green指示剂和健康细胞CytoCalcein指示剂的分析缓冲液中，在室温下孵育1 h。用分析缓冲液洗涤细胞，使用Zeiss LSM 880在×10倍镜下成像。激发/发射参数:Apopxin Green-488/525 nm, CytoCalcein-405/450 nm。

六、Transwell细胞侵袭实验

Transwell迁移实验中，将转染或未转染的肺癌细胞接种到未包被的96孔插入物的上部。侵入性分析使用涂有Matrigel (BD Biosciences)的transwell室(康宁公司)进行。Matrigel在4 ℃解冻，以1:2的比例稀释在DMEM中。转染后，肺癌细胞(2×104)在上室不含胎牛血清的培养基和下室含胎牛血清-DMEM的培养基中培养。孵育36 h后，用棉签去除过滤器顶部的细胞。浸润过滤器下表面的细胞用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15 min，室温下用0.5%结晶紫染色。在光学显微镜下观察细胞。

七、肺癌细胞小鼠移植癌模型

选择48只SPF级，4～6周龄，体重21～30 g雌性裸小鼠为实验动物，分为4组(n=12)，oe-NC、oe-MAGI2-AS3、sh-NC、sh-RACGAP1。各组慢病毒转染6×106个/mL PG49细胞。细胞培养24 h，收集并注射到动物体内。注射前，将细胞与基质胶按体积比1:1混匀后，于裸鼠右侧腋下接种3×106个细胞(0.2 mL悬液)。观察肿瘤生长情况，两天测量一次小鼠的体重和肿瘤大小。肿瘤大小计算公式：V(mm3)=1/2L×D2。饲养4周后CO2法处死裸鼠，剥离肿瘤，称重。

八、 统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件进行处理，计量资料采用均值±标准差的形式表示，首先进行正态性和方差齐性检验，检验符合正态分布且方差齐，则两组间比较为非配对t检验，每组三次重复，多组间的比较应采用单因素方差分析，多组之间两两比较，采用SNK-Q检验的方法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、 lncRNA MAGI2-AS3在肺癌细胞中的作用

qRT-PCR结果显示，与对照组相比，过表达MAGI2-AS3后，肺癌细胞系PG49中MAGI2-AS3相对表达量明显增加(t=1.91，P<0.01)(见图1)。

图1 qRT-PCR检测各组lncRNA MAGI2-AS3转染效率注：表示与oe-NC组相比：*P<0.05。

二、 lncRNA MAGI2-AS3对PG49细胞增殖的影响

EdU增殖实验结果显示，过表达MAGI2-AS3后，EdU阳性细胞数较oe-NC组显著下降(t=1.77，P<0.01)(见图2)。

图2 调控肺癌细胞系PG49中lncRNA MAGI2-AS3含量对细胞增殖的影响，DAPI(蓝色)染色细胞核， FITC(绿色)标记MAGI2-AS3蛋白(800×)

三、 lncRNA MAGI2-AS3对PG49细胞凋亡的影响

细胞凋亡/坏死检测结果显示，过表达MAGI2-AS3后，凋亡细胞数较oe-NC组显著增多(t=1.30，P<0.05)(见图3)。

图3 肺癌细胞中lncRNA MAGI2-AS3含量对细胞凋亡的影响；标尺为50μm，(×200)

四、 lncRNA MAGI2-AS3对细胞迁移的影响

Transwell侵袭实验结果显示过表达MAGI2-AS3后，侵袭细胞数较oe-NC组显著下降(t=2.49，P<0.01)(图4)。以上结果说明lncRNA MAGI2-AS3对肺癌有抑制作用。

图4 调控肺癌细胞中lncRNA MAGI2-AS3含量对细胞迁移的影响；标尺为50μm (×400)

五、 lncRNA MAGI2-AS3在体内抑制肺癌

体内实验结果显示，sh-RACGAP1组瘤体积显著小于sh-NC组；oe-MAGI2-AS3组形成的肿瘤体积明显小于oe-NC组；说明MAGI2-AS3在体内可以抑制肺癌的发展(sh-RACGAP1组vs.sh-NC组P<0.05；oe-MAGI2-AS3组vs.oe-NC组P<0.05)，sh-RACGAP1组瘤的重量显著小于sh-NC组；oe-MAGI2-AS3组形成的肿瘤的重量明显小于oe-NC组(sh-RACGAP1组vs.sh-NC组P<0.05；oe-MAGI2-AS3组vs.oe-NC组P<0.05)(见图5)。综上所述，在体内过表达MAGI2-AS3或抑制RACGAP1表达，可抑制肿瘤生长。

图5 四周后各组肺癌模型小鼠移植瘤体积大小和瘤体质量

讨 论

肺癌发病率和死亡率目前居恶性肿瘤的首位，探究新的肺癌相关基因对研究其发病机制及研发新的诊断和治疗药物有重要意义。虽然大多数肺癌与吸烟有关，但世界卫生组织统计，全世界25%的肺癌发生在从不吸烟的人群中[9]，与几十年前肺癌主要是吸烟男子常患疾病形成鲜明对比的是，现在妇女肺癌的发病率与男子相当或高于男子，并且在世界许多地区正以惊人的速度上升。因此，仅仅是避免吸烟，并不能很好的降低肺癌的发病率，仍然需要从源头上解决肺癌发病问题。研究表明RNA通常可以根据它们是否具有编码蛋白质的能力分为两类蛋白质编码RNA和非编码RNA，非编码RNA (ncRNA) 约占所有基因组转录物的98%，可分为短 ncRNA(<200个核苷酸)和长 ncRNA(lncRNA，>200个核苷酸)[10]。大多数肺癌病人确诊时已是晚期且出现了转移，手术不能彻底根治，因此分子靶向药物因其靶向、安全、方便等优点成为研究的热点，分子机制的研究至关重要。lncRNA可通过相互调控作用，促进或抑制肿瘤的形成、进展，并且对肺癌的增殖、侵袭、转移、预后及诊断等起重要作用[11]。本研究，过表达MAGI2-AS3后，凋亡细胞数显著增多，说明MAGI2-AS3促进肺癌细胞凋亡。据相关研究报道，MAGI2-AS3在乳腺癌组织中的表达下调，过表达MAGI2-AS3可通过靶向miR-374a/PTEN通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭[12]。此外，还有研究发现，非小细胞肺癌患者血浆和血小板中MAGI2-AS3的水平明显低于健康对照组，MAGI2-AS3水平与肿瘤转移(TNM)分期、淋巴结转移、远处转移有相关性[13]。已知，MAGI2-AS3在非小细胞肺癌中表达下调，过表达MAGI2-AS3通过miR-23a-3p/PTEN轴抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力，与本研究中，MAGI2-AS3抑制肺癌细胞迁移和侵袭的结果相符合[14]。已知，MAGI2-AS3通常在肺癌等肿瘤中表达。本研究结果表明过表达MAGI2-AS3抑制肺癌细胞增殖。在肺癌瘤体内模型中，过表达MAGI2-AS3，可抑制肿瘤生长，过表达MAGI2-AS3后，小鼠移植瘤组织体积与重量均明显下降。目前研究已经证实，RACGAP1在结直肠癌、子宫癌肉瘤、胃癌、结直肠癌和食管癌等多种恶性肿瘤呈现高表达[15]。在本研究中，过抑制RACGAP1表达，可抑制肿瘤生长小鼠移植瘤组织体积与重量均明显下降。

研究报道，MAGI2抑制肝癌细胞的增殖、迁移及促进其凋亡[16]。前期研究表明，lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神经母细胞瘤组织和细胞系中均低表达，过表达lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表达上调，表明MAGI2-AS3可能通过抑制Fas/FasL信号通路，而潜在地抑制神经母细胞瘤的生长[17]。本研究发现，过表达MAGI2-AS3可以抑制PG49细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，表明MAGI2-AS3在肺癌的调控过程中起到关键作用。

本研究证实在肺癌细胞中，上调MAGI2-AS3可抑制肺癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。MAGI2-AS3是肺癌的潜在分子靶点，为肺癌的分子靶向治疗提供了潜在的研究方向。