miR-637靶向SCUBE3对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

黄洋峰，赵海明，罗玉明，汪 英，唐 鹏

0 引 言

结肠癌(colon cancer，CC)是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一[1]。且由于全球城市地区的快速工业化和生活方式的改变，结肠癌的发病率出现了惊人的增长[2-3]。目前结肠癌形成及转移的相关分子机制仍未完全清晰，因此，揭示结肠癌发生的相关分子机制对提高结肠癌的治疗和预后具有重要意义。近年来，微小RNA(microRNAs，miRNAs)已被报道参与调控包括结肠癌在内的多种癌症的大部分特征[4-5]。已有研究报道miR-637被证明通过抑制钙网蛋白而加重内质网应激诱导的胃癌细胞凋亡[6]。miR-637还被发现通过靶向降解AKT1来抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[7]。此外，miR-637可能通过干扰组织蛋白酶B的表达来抑制胆管癌QBC939细胞的增殖[8]。值得注意的是，研究表明在大肠癌中通过海绵miR-637的自噬，CircHIPK3促进了奥沙利铂的耐药性[9]，提示miR-637可能在结肠癌中发挥重要作用。

信号肽-CUB-EGF样结构域蛋白3(signal peptide CUB EGF-like domain-containing protein 3，SCUBE3)是SCUBE基因家族的成员，位于人6号染色体上，最初发现于人脐静脉内皮细胞[10-11]。研究表明SCUBE3主要在中枢神经系统、性腺、血管内皮细胞、心脏和骨骼等正常组织中表达[12]。此外，SCUBE3高表达与肺癌、肿瘤大小、肿瘤转移、预后不良及骨肉瘤预后相关[13-14]。最近的研究表明，SCUBE3激活TGFβ1调节TWIST1的表达从而促进乳腺癌的发生[15]。然而，SCUBE3在结肠癌中的表达和功能尚未见报道。因此，本研究拟探讨miR-637靶向SCUBE3在结肠癌细胞中的作用及可能的分子机制，以期为结肠癌靶向药物的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料本研究收集了2021年5月至2021年8月在本院就诊并经病理证实的20份结肠癌及癌旁正常组织，从病灶和邻近的非癌组织(距肿瘤边缘≥5 cm)中取出新鲜组织，立即冷冻于液氮中，在-80 ℃保存直至使用。

1.2质粒构建将SCUBE3基因克隆到pcDNA3.1中进行高效表达，将miR-637序列合成到pSI-check2载体中(汉恒生物科技(上海)有限公司)，直接定向构建携带前miRNA的重组表达载体。用限制性内切酶技术(Thermo Fisher Science)扩增人SCUBE3基因的3′-UTR，并将其亚克隆到pSI-check2载体中的Renilla荧光素酶终止密码子下游，所有构建物均经测序证实。

1.3细胞培养和转染人293T和HCT-116细胞系购自中国科学院(上海)模式培养库细胞库，用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM，GIBCO，Carlsbad，CA，USA)于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。将细胞分为空白组、阴性对照组、miR-637 mimic、miR-637-inhibitor、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-SCUBE3、miR-637 mimic+ pcDNA3.1-SCUBE3。miR-637 mimic、miR-637-inhibitor和阴性对照(scramble)购自上海吉玛制药技术有限公司，利用pcDNA3.1-SCUBE3质粒过表达SCUBE3，所有的转染检测根据制造商的说明使用Lipofectamine© 2000试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Carlsbad)进行的转染，转染48 h后收集细胞，进行后续实验。

1.4qRT-PCR分析采用TRIZOL©试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)根据制造商说明从组织/细胞中提取总RNA，测定RNA浓度，逆转录酶试剂盒(Takara Bio，Japan)用于逆转录，使用SYBR Green PCR Master Mix(Takara Bio)与ABI StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，CA)进行qPCR，记录CT值，采用2-△△CT分析相对表达水平，分别以β-actin和U6为内参计算SCUBE3 mRNA和miR-637的表达量，实验重复3次。

1.5免疫组化染色取癌组织及癌旁组织，经4%的多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片(5 μm)，0.3% H2O2抑制切片中的内源性过氧化物酶活性，10%的正常山羊血清封闭非特异性蛋白结合位点。然后将切片与抗SCUBE3(Abcam)抗体4 ℃过夜，后与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgGs二抗37 ℃孵育30 min，苏木精染色，镜检观察，并使用Image-J图像分析软件根据积分光密度(IOD)/面积值确定SCUBE3阳性染色的强度。

1.6CCK-8法检测细胞增殖采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测miR-637过表达和下调对HCT-116细胞增殖的影响，将制备好的细胞悬液接种于96孔板(100 μL/孔)，细胞密度为3×103细胞/孔，在37 ℃培养箱中培养24 h后向每孔中加入10 μL CCK-8试剂(DojindoMolecular Technologies，Japan)，继续于培养箱中培养3 h，然后通过酶标仪评估每个孔在450 nm处的吸光度，实验重复3次。

1.7流式细胞术分析细胞凋亡用胰酶消化HCT-116细胞，收集并制备成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤3次。然后用含10 μL Annexin V-APC的200 μL细胞悬液染色，4 ℃黑暗中孵育。随后加入10 μL碘化丙啶(PI)，并立即用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行分析。

1.8Western blot分析使用RIPA裂解缓冲液(上海碧云天生物)提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白质分析试剂盒(南京诺唯赞生物)按照制造商说明测量蛋白质浓度，蛋白质样品经10%SDS-PAGE分离后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜2 h，后与一抗SCUBE3(1∶1000，Abcam)、Bcl-2(1∶1000，Abcam)、Bax(1∶1000，Abcam)、cleaved caspase-3(1∶1000，Abcam)、TGF-β R2(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)、p-Smad2(1∶1000，Abcam)、p-Smad3(1∶1000，Abcam)和β-actin(1∶1000，Abcam)4 ℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的山羊二抗(1∶10000，Abcam)室温孵育2 h，TBST洗涤4次，ECL化学发光检测试剂盒(南京诺唯赞生物)显色，用ImageJ软件(version 1.41，National Institutes of Health，USA)对条带的强度进行量化，实验重复3次。

1.9双荧光素酶测定法以96孔板培养的293T细胞与质粒共转染，探讨miR-637与SCUBE3-3′-UTR的相互作用，转染6 h后更换新鲜培养液，转染48 h后收集细胞进行检测。使用双荧光素酶检测试剂盒(Promega Corporation，USA)进行双荧光素酶活性检测。根据萤火虫荧光强度/海肾荧光强度比值来反映不同处理组的相对荧光强度。

2 结 果

2.1 癌组织中miR-637和SCUBE3的表达水平结肠癌组织中miR-637的表达水平(0.61±0.03)较癌旁组织(1.21±0.06)显著下调，而SCUBE3在结肠癌组织中的表达(1.81±0.09)较癌旁组织(0.98±0.04)显著上调(P<0.01)；免疫组化染色图像显示SCUBE3在结肠癌组织中的光密度值(0.17±0.01)显著增加，见表1，图1。

表1 结肠癌组织中SCUBE3的表达水平

1:样本1；2：样本2；3：样本3

2.2miR-637过表达抑制HCT-116细胞增殖qRT-PCR检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic转染后HCT-116细胞中的miR-637表达显著增强，miR-637 inhibitor转染后HCT-116细胞中的miR-637表达显著降低(P<0.05)；CCK-8检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic转染后HCT-116细胞增殖被显著抑制(P<0.01)，而miR-637 inhibitor转染后可促进HCT-116细胞增殖(P<0.05)。见表2。

表2 miR-637过表达抑制HCT-116细胞增殖

2.3miR-637过表达可促进HCT-116细胞凋亡流式细胞凋亡检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic转染后HCT-116细胞凋亡显著增加(P<0.01)，而miR-637 inhibitor转染可减少细胞凋亡，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic转染可显著增加Bax蛋白表达，显著降低Bcl-2蛋白表达(P<0.01)，而miR-637 inhibitor组的作用相反，见图3。

1:空白组；2：阴性对照组；3：miR-637 mimic；4：miR-637 inhibitor

1：空白组；2：阴性对照组；3：miR-637 mimic组；4：miR-637 inhibitor组与阴性对照组比较，*P<0.05、**P<0.01

2.4SCUBE3是miR-637的直接靶基因TargetScan在线工具(www.targetscan.org/)预测了SCUBE3作为miR-637可能的靶基因，见图4。双荧光素酶报告基因检测显示，miR-637 mimic-SCUBE3 3′-UTR-wt转染细胞的荧光素酶活性(0.65±0.03)显著低于阴性对照-SCUBE3 3′-UTR-wt组(1.01±0.04)，差异有统计学意义(P<0.01)，转染miR-637 mimic-SCUBE3 3′-UTR-mut的细胞荧光素酶活性无明显差异(P>0.05)。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic组SCUBE3在mRNA和蛋白水平的表达显著降低(P<0.05)，而miR-637 inhibitor组的作用相反。见图5。

图4 TargetScan预测SCUBE3作为miR-637可能的靶基因

1：空白组；2：阴性对照组；3：miR-637 mimic组；4：miR-637 inhibitor组

2.5SCUBE3过表达逆转miR-637对HCT-116细胞的作用Western blot检测结果显示，与pcDNA3.1-NC相比，pcDNA3.1-SCUBE3组SCUBE3蛋白水平显著增加(P<0.05)，见图6。流式细胞检测结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic组细胞凋亡率显著增加，而pcDNA3.1-SCUBE3处理明显抑制了miR-637 mimic的促凋亡作用(P<0.01)，见图7。凋亡相关蛋白表达结果显示，与阴性对照组相比，miR-637 mimic组Bax、c-caspase-3蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著降低，pcDNA3.1-SCUBE3组则起到相反的作用，且pcDNA3.1-SCUBE3处理可以逆转miR-637 mimic的作用(P<0.05)，见图8。

1：空白组；2：pcDNA3.1-NC组；3：miR-637 mimic组

与阴性对照组相比，*P<0.01；与miR-637 mimic组相比，#P<0.01

1：空白组；2：阴性对照组；3：miR-637 mimic组；4：pcDNA3.1-SCUBE3组；5：miR-637 mimic+ pcDNA3.1-SCUBE3组

2.6miR-637抑制HCT-116细胞TGF-β/Smad通路与阴性对照组相比，miR-637 mimic组p-smad2、p-smad3、TGF-β R2蛋白表达显著降低，pcDNA3.1-SCUBE3组p-smad2、p-smad3、TGF-β R2蛋白表达显著升高(P<0.05)，与miR-637 mimic组相比，miR-637 mimic+ pcDNA3.1-SCUBE3组p-smad2、p-smad3、TGF-β R2蛋白表达显著升高(P<0.01)。见图9。

1：空白组；2：阴性对照组；3：miR-637 mimic组；4：pcDNA3.1-SCUBE3组；5：miR-637 mimic+ pcDNA3.1-SCUBE3组

3 讨 论

尽管手术切除和化疗是治疗结肠癌的有效方法，但肿瘤复发和化疗耐药仍然是结肠癌治疗的主要挑战。已知许多miRNAs参与肿瘤的发生、癌症的进展和细胞凋亡[16]。研究报道miR-637是PANDAR在甲状腺癌中的靶点，PANDAR可作为治疗甲状腺癌的新靶点[17]。miR-637在卵巢癌组织和细胞中下调，miR-637抑制剂部分削弱了circ_0013958敲除对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的抑制作用，且miR-637靶向PLXNB2抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭[18]。此外，miR-637在结直肠癌组织和细胞中的水平下降，miR-637靶向WNT1来抑制细胞迁移、侵袭和诱导细胞凋亡[19]。本研究发现结肠癌组织中miR-637的表达水平低于癌旁正常组织。随后本研究合成miR-637 mimic和inhibitor以探讨其体外功能，结果表明miR-637过表达可抑制HCT-116细胞的增殖，提示miR-637可能是结肠癌抑制因子miRNA。此外，据报道肿瘤的生长不仅取决于细胞的增殖率，还取决于细胞凋亡率[20]。细胞凋亡作为癌症治疗的一个潜在靶点已被广泛研究[21]。研究发现miR-370被证明通过直接靶向MDM4促进结肠癌细胞凋亡[22]。miR-1184过表达通过上调cleaved-caspase-3和下调Bcl-2的表达来促进结肠癌细胞的凋亡，从而抑制结肠癌细胞的增殖[23]。已证实某些基因，包括抗凋亡基因(Bcl-2)和促凋亡基因(Bax)，是结肠癌细胞凋亡的重要调节基因，决定了细胞的命运[24]。此外，caspase-3也是细胞凋亡的关键执行者，被发现是参与激活不同蛋白质导致细胞程序性死亡的酶之一[25]。本研究结果发现miR-637 mimic组HCT-116细胞凋亡率明显增加，且细胞中Bax的表达显著增加，Bcl-2的表达显著降低，提示miR-637可明显诱导细胞凋亡。

SCUBE3在癌症研究中被发现可通过促进血管生成和上皮-间充质转化参与肺癌的调控，从而促进上皮细胞的迁移和侵袭[15]。此外，SCUBE3还促进骨肉瘤细胞的增殖并与患者预后相关[14]。SCUBE3过表达预示着非小细胞肺癌预后不良[13]。本研究发现结肠癌组织中SCUBE3的表达水平显著上调，且通过基因库筛查发现SCUBE3为miR-637的直接靶基因，双荧光素酶报告实验证实了miR-637与SCUBE3之间的直接靶点关系，miR-637的过表达在mRNA和蛋白水平上降低了SCUBE3的表达，而过表达SCUBE3能够逆转miR-637的促凋亡作用，证实miR-637通过抑制SCUBE3促进HCT-116细胞凋亡。TGF-β信号通路被发现参与了几个关键的生物学过程，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡[26]。在配体结合后，TGF-β R2招募并磷酸化下游转录因子Smad2和Smad3[27]。TGF-β已被报道能促进或抑制结肠癌细胞的凋亡[28]。然而，miR-637对结肠癌中TGF-β/Smad通路的影响尚不清楚。本研究证实miR-637过表达可抑制TGF-β R2、p-smad2、p-smad3的表达，而SCUBE3则上调这些蛋白的表达，提示miR-637对TGF-β/Smad信号的负调控作用。

综上所述，本研究发现结肠癌组织中miR-637表达下调，SCUBE3表达上调，miR-637过表达可促进HCT-116细胞凋亡及抑制细胞增殖，SCUBE3基因可能为结肠癌中miR-637的靶基因。进一步研究表明，miR-637可能通过抑制SCUBE3的表达和TGF-β/Smad信号通路来抑制结肠癌的发生，提示miR-637和SCUBE3可能是结肠癌治疗的关键调控因子和新靶点。