气相色谱-负化学源质谱法测定辣椒中咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚

李 萍，徐蓓蓓，郑钦月，王路路，刘文芳

（1.柘城县综合检验检测中心，河南 商丘 476200；2.中检集团中原农食产品检测（河南）有限公司，河南 郑州 450000）

咪鲜胺作为一种广谱咪唑类杀菌剂，对辣椒枯萎病具有很好的防治效果[1]，因此被广泛应用于辣椒的种植及采摘保鲜中。咪鲜胺进入环境后，会生成代谢产物2,4,6-三氯苯酚，其具有显著的毒理学效应和潜在致癌性，可对人类神经系统和呼吸系统造成不良影响，如引起慢性支气管炎、咳嗽和肺功能改变等[2]。2,4,6-三氯苯酚已经被美国环境保护署（EPA）列为优先污染物，在我国也被确定为水体中的优先污染物[3]。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[4]中规定辣椒中咪鲜胺的最大残留限量为2 mg/kg，残留量以咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚之和计。但目前的检验方法标准仅有NY/T 1456—2007《水果中咪鲜胺残留量的测定 气相色谱法》[5]，且该标准的适用范围不包括辣椒及其他蔬菜。

咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚的检测分析方法有光谱法[6]、电化学法[7]、气相色谱法[8-9]、液相色谱法[10-12]、气相色谱-质谱联用法[13-16]和液相色谱-质谱联用法[17-19]。光谱法、电化学法、气相色谱法、液相色谱法样品的前处理不仅复杂繁琐，且还会用到毒性较大的吡啶盐酸盐，不利于检验人员的健康和环境的安全，液相色谱-质谱联用法对设备要求比较高。气相色谱-质谱法检测咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚时常采用电子轰击离子源（Electron ionization，EI）。由于EI源不具有选择性，分析物容易受到多杂质干扰，易造成假阳性。研究表明，化学离子源（Chemical ionization，CI）对特定基团的化合物也具有较好的电离效果。比如负化学离子源（Negative chemical ionization，NCI）具有较弱的电离性，产生的碎片离子少，对含卤原子具有较好的选择性和较高的灵敏度[20]。同时，正化学离子源（Positive chemical ionization，PCI）对于含氮杂环化合物有响应，而对很多杂质没有响应，从而可以消除多数无法离子化杂质的干扰，不易出现假阳性[21]。由于咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚分子结构中含氮杂环以及电负性氯原子（图1），因此具有NCI电离的可能性。本文通过采用不同的离子源和化学电离源研究同时测定辣椒中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的方法，以期获得良好的灵敏度和选择性，降低假阳性。

图1 咪鲜胺（A）及2,4,6-三氯苯酚（B）的化学结构式Fig.1 The chemical structure of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophenol(B)

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

辣椒，市售；咪鲜胺（标准品浓度100μg/mL）、2,4,6-三氯苯酚（标准品浓度100μg/mL），农业农村部环境保护科研监测所；丙酮（色谱纯），德国Merck公司。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（Primary secondary amine,PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black,GCB）、陶瓷均质子、有机微孔滤膜（孔径0.45μm），美国Agilent公司。

1.1.2 仪器与设备

7890B-7200气相色谱串联飞行时间质谱仪，美国Agilent公司；AB204 N电子天平（精确至0.1 mg），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱参数

色谱柱：VF-1701 ms（30 m×250μm×0.25μm）；进样量：1μL；进样方式：不分流；进样口温度：260℃；恒流模式，流速1.2 mL/min；传输线温度：280℃；程序升温：初温60℃，30℃/min升至280℃，280℃保持8 min。

1.2.2 质谱参数

负化学离子源，离子源温度150℃，发射电流20.0μA，电子能量250.0 eV，质谱采集模式Scan，采集范围35～500 u，采集频率2 Spec/s。

1.2.3 标准溶液的配制

以丙酮为溶剂，分别移取咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚标准品溶液，配成两种10.0μg/mL的标准储备液，再稀释至质量浓度0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL的系列标准溶液。

1.2.4 净化方式的筛选

称取10 g辣椒，加入10 mL乙腈，均质后加入2 g氯化钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，取3 mL上清液待净化。在3 mL待净化液中分别加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，净化管中均加入300 mg无水硫酸钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，过0.45μm有机滤膜，取1 mL分别加入0.2μg咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述仪器条件测定。测定结果分别计为B-PSA、B-C18、B-GCB。

称取10 g辣椒，分别加入2μg咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚，加入10 mL乙腈，均质后加入2 g氯化钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，取3 mL上清液待净化。在3 mL待净化液中分别加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，净化管中均加入300 mg无水硫酸钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，过0.45μm有机滤膜，待测。测定结果分别计为C-PSA、C-C18、C-GCB。

以丙酮为溶剂分别配制0.2μg/mL咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚，待测。测定结果计为A。

以上测定结果均以定量离子峰面积表示。

净化方式通过基质效应和回收率评价。基质效应的计算参照Matuszewski等[22]的方法。

式中：ME为前处理过程总基质效应，%；B为目标化合物在阴性样品处理液基质中检测的峰面积；A为目标化合物在纯溶剂基质中检测的峰面积；RE为前处理过程回收率，%；C为目标化合物经过前处理后处理液基质中检测的峰面积；PE为折算回收率后的基质效应，%。

1.2.5 定性定量计算

采用“1.2.2”质谱参数中NCI采集。咪鲜胺定量离子m/z为163.063 3，定性离子m/z为161.065 5；2,4,6-三氯苯酚定量离子m/z为196.045 2，定性离子m/z为160.057 4，基质外标法定量。

1.2.6 线性范围和定量限的测定

在空白辣椒基质中分别添加0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述仪器条件测定。以物质浓度为横坐标，定量离子丰度为纵坐标进行线性回归，确定线性范围。

称取10 g没有检出咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分别加入咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚混标，添加水平均为0.1、0.2、0.5μg/mL，加入10 mL乙腈，均质后加入2 g氯化钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，取3 mL上清液待净化。在3 mL待净化液中加入100 mg C18和300 mg无水硫酸钠，涡旋振荡，4 000 r/min离心3 min，过0.45μm有机滤膜，上机测试，结果以10倍信噪比确定定量限。

1.2.7 精密度和准确性的测定

称取10 g未检出咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分别添加不同含量水平（0.05、0.20、1.00 mg/kg）咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚混标，进行精密度、准确性验证，精密度以相对标准偏差（RSD）表示，准确度以加标回收率表示，每个浓度重复测定3次（n=3）。

1.2.8 数据处理

采用Excel处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚质谱采集模式的研究

以丙酮为溶剂分别配成5μg/mL咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚标准品溶液，采用“1.2.1”中的气相色谱参数采集，获得咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的色谱图（图2）。由图2可以看出，咪鲜胺的保留时间为13.396 min，2,4,6-三氯苯酚的保留时间为5.177 min，分离效果较好。咪鲜胺在NCI模式下的特征离子m/z主要为163.063 3（定量离子）、161.065 5（定性离子）；2,4,6-三氯苯酚在NCI模式下的特征离子m/z主要为196.045 2（定量离子）、160.057 4（定性离子）。

图2 NCI模式下咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚标准样品色谱图Fig.2 Chromatogram of standard samples of prochloraz and 2,4,6-trichlorophphenol in NCI mode

2.2 净化吸附剂对咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚提取效果的影响

基质效应抑制率高，回收率接近100%，则认为净化效果好。RE值接近100%，说明吸附剂对目标物产生的吸附效果弱；RE值较低，说明吸附剂对目标物产生的吸附效果强，目标物回收率低。不同处理方式下咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚峰面积测定结果见表1，基质效应计算结果见表2。由表2可知，咪鲜胺经过PSA、C18处理，RE值接近100%，几乎没有被吸附；经GCB处理，RE值仅17.7%，说明GCB对咪鲜胺产生较强吸附。2,4,6-三氯苯酚经过C18处理，RE值接近100%，经PSA、GCB处理，RE值分别为33.2%、58.2%，说明GCB对2,4,6-三氯苯酚也产生较强吸附，与咪鲜胺相比，2,4,6-三氯苯酚极性大，而PSA能够消除极性杂质。

表1 不同处理方式下咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚峰面积测定结果Table 1 Results of determination of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments

表2 不同处理方式下咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚基质效应Table 2 Matrix effects of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments 单位：%

综上所述，在同时检测咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚时，可使用C18处理亲脂性杂质，使用PSA、GCB可能造成回收率降低。C18处理后咪鲜胺ME值为119.4%，2,4,6-三氯苯酚ME值为157.5%，说明都产生了基质放大效应。因此本研究使用C18作为净化吸附剂，为降低基质效应干扰，定量使用基质标曲外标法定量。

2.3 定量限和线性范围

由图3中的标准曲线可以看出，咪鲜胺、2,4,6-三氯苯酚在0.01～1μg/mL的质量浓度范围内的线性回归方程分别为：y=2 284x-4.217 8，y=402 327x-1 617.9，R2分别为0.999 5、0.999 1，说明拟合度较好。

图3 咪鲜胺(A)和2,4,6-三氯苯酚(B)的标准曲线Fig.3 The standard curve of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophphenol(B)

结果表明，加标浓度0.05 mg/kg时，咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚混标定量离子信噪比均大于10，因此，咪鲜胺及2,4,6-三氯苯定量限均为0.05 mg/kg。

2.5 精密度和准确性

由表3可见，在添加水平0.05～1.00 mg/kg范围内，咪鲜胺在辣椒中的回收率为85.0%～92.3%，RSD为0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚的回收率为82.3%～96.4%，RSD为0.8%～1.7%。表明该方法准确性、精密度良好。

表3 咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚加标回收率及精密度Table 3 Spike recovery and precision of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

3 结论与讨论

采用气相色谱-负化学源质谱法研究了咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留量的检测方法，结果表明：NCI模式下，对咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的定量限均为0.05 mg/kg；研究对比了净化吸附剂PSA、C18和GCB的净化效果，由于PSA和GCB对咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚产生较强吸附，因此最终选择C18为前处理净化吸附剂；在添加水平0.05～1.00 mg/kg范围内，咪鲜胺在辣椒中的回收率为85.0%～92.3%，RSD为0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚在辣椒中的回收率为82.3%～96.4%，RSD为0.8%～1.7%。该方法准确性、精密度良好，且简单、快速、高效，可用于同时对咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留量的定性和定量分析。