微小RNA-221和巨噬细胞迁移抑制因子及血栓调节蛋白与心房颤动合并缺血性脑卒中的相关性

郭泉，张怡，李海军，高珊

咸阳市中心医院干部保健科1、老年病科2、临床营养科3，陕西 咸阳 712000

心房颤动(房颤)是一种以持续性心房电活动紊乱为主要形式的心律失常，可明显增加脑卒中和左心室功能不全风险，致残致死率较高，威胁患者生命安全[1]。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factors，MIF)主要由巨噬细胞分泌，参与机体炎性反应[2]。近年来研究发现，MIF具有调节其他促炎因子释放的功能，并能促进炎性细胞聚集，在动脉粥样硬化斑块发生和进展中起到重要作用[3]。还有报道指出，房颤患者血浆微小RNA(microRNA，miR)-221水平相对于正常人群较高，认为miR-221参与房颤的发生过程[4]。血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)是反映血栓形成的重要指标，心血管疾病患者往往TM水平明显升高，提示TM参与心血管疾病的发生发展[5]。上述研究均显示，MIF、miR-221及TM与房颤发生密切相关，但具体发生机制尚未完全明确[6]。因此为进一步探讨上述因子参与房颤的具体机制，本研究对上述因子与房颤的心房重构相关性进行分析，以期了解上述因子在房颤患者心房重构时的机制，为临床治疗房颤提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年1月至2021年5月在咸阳市中心医院住院治疗且符合以下纳入和排除标准的83例房颤合并缺血性脑卒中患者作为研究组，其中男性44例，女性39例；年龄63～84岁，平均(70.33±1.25)岁；发病至入院3～9 h，平均(5.87±1.01)h；TOAST分型：小动脉闭塞型16例，大动脉粥样硬化型25例，心源性脑栓塞20例，其他22例；小学至初中27例，高中34例，大专至以上22例。研究组患者根据房颤性质分为阵发性房颤组45例，持续性房颤组38例；同时根据改良的Rankin量表(mRS)评分分为两组，其中22例＞3分者纳入预后不良组，余61例≤3分者纳入预后良好组[7]。将同期我院收治的60例缺血性脑卒中患者作为对照组，其中男性33例，女性27例；年龄64～85岁，平均(70.59±1.20)岁；发病至入院3～8 h，平均(5.62±1.08)h；TOAST分型：小动脉闭塞型14例，大动脉粥样硬化型18例，心源性脑栓塞16例，其他12例；小学至初中20例，高中23例，大专至以上17例。纳入标准：(1)符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[8]、《心房颤动基层诊疗指南(2019年)》[9]诊断标准，并经过心电图等检查确诊；(2)病例资料完整。排除标准：(1)听力或者交流障碍者；(2)合并甲状腺功能亢进、重度贫血、风湿性心脏病、恶性肿瘤、精神类疾病；(3)具备出血倾向的抗凝禁忌证。将50例在我院体检的健康人群作为健康组，其中男性28例，女性22例；年龄61～82岁，平均(70.69±1.36)岁；小学至初中13例，高中20例，大专至以上17例。研究组、对照组和健康组受检者的性别、年龄和文化水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经我医学院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 检测方法抽取各组研究对象的静脉血6 mL，在4℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上层血清待检。其中3 mL用于TRIZOL试剂盒提取血清总RNA，利用逆转录试剂盒提取RNA反转录成为cDNA，选择ABI 7500定量PCR仪进行实时PCR，miR-221上游引物：5'-CCGCAGCTACATCTGGCTACTG-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，反应条件：95℃条件下10 min预变性；95℃时15 s变性；69℃时1 min退火，重复40次，选择2-△△Ct法计算miR-221的相对表达量。剩余3 mL通过酶联免疫吸附法试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20190105)、TM检测试剂盒(美国Neomarker公司，批号20181205)、酶联免疫分析仪(日本东曹株式会社，AIA-2000ST)，首先将样品置于冰上缓慢融化，依据要求稀释，每孔放入空白对照，带侧孔设立复孔，利用封板胶纸堵住反应孔，置于室温环境下，清除胶膜与孔内液体，重复缓冲4次，每孔中添加检测抗体，堵住反应孔，室温保存2 h。清除胶膜与孔内液体，重复缓冲4次，每孔中添加标记链酶亲和素，封闭反应孔，室温保存30 min，清除胶膜与孔内液体，重复缓冲4次，再次添加标记链酶亲和素，避光室温下保存20 min，等待变色，最后在每孔中添加终止液，测定数值。严格依据说明书要求测定MIF、TM。

1.3 观察指标(1)比较研究组、对照组和健康组受检者的miR-221、MIF、TM水平；(2)比较阵发性房颤组与持续性房颤组患者的miR-221、MIF、TM水平；(3)比较预后良好组与预后不良组的一般临床资料，分析影响房颤合并缺血性脑卒中患者预后的危险因素；(4)评价心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM与房颤合并缺血性脑卒的相关性。

1.4 统计学方法应用SPSS18.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson相关性分析心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM与房颤合并缺血性脑卒的相关性；采用多因素Logistic回归方程分析影响房颤合并缺血性脑卒中患者预后的危险因素。均以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组、对照组和健康组受检者的各项指标比较研究组患者的miR-221、MIF、TM水平明显高于对照组和健康组，而健康组体检者的miR-221、MIF、TM水平明显低于研究组和对照组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 研究组、对照组和健康组受检者的各项指标比较(±s)

表1 研究组、对照组和健康组受检者的各项指标比较(±s)

注：与健康组比较，aP＜0.05；与研究组比较，bP＜0.05。

组别研究组对照组健康组F值P值TM(μg/L)48.59±6.17a 30.26±4.22ab 17.88±1.61b 692.300 0.001例数83 60 50 miR-221 1.42±0.37a 1.06±0.25ab 0.67±0.12b 108.290 0.001 MIF(ng/L)1 469.23±50.20a 1 087.56±42.18ab 582.46±20.53b 7 043.040 0.001

2.2 阵发性房颤组与持续性房颤组患者的各项指标比较阵发性房颤组患者的miR-221、MIF、TM水平明显低于持续性房颤组，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 阵发性房颤组与持续性房颤组患者的各项指标比较(±s)

表2 阵发性房颤组与持续性房颤组患者的各项指标比较(±s)

注：与健康组比较，aP＜0.05；与研究组比较，bP＜0.05。

组别阵发性房颤组持续性房颤组t值P值TM(μg/L)44.20±5.80 50.38±6.59 4.494 0.001例数45 38 miR-221 1.33±0.30 1.62±0.44 3.442 0.001 MIF(ng/L)1 309.46±45.29 1 577.84±48.01 26.168 0.001

2.3 预后良好组与预后不良组患者的临床资料比较两组患者合并糖尿病、感染、高脂血症、高血压、肥胖比例比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；预后良好组患者的年龄、女性、心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM水平明显低于预后不良组，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，见表3。

表3 预后良好组与预后不良组患者的一般临床资料比较[±s，例(%)]

表3 预后良好组与预后不良组患者的一般临床资料比较[±s，例(%)]

2.4 各项指标与房颤合并缺血性脑卒中的相关性经Pearson相关性分析结果显示，心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM与房颤合并缺血性脑卒中呈正相关(P＜0.05或P＜0.01)，见表4。

表4 各项指标与房颤合并缺血性脑卒中的相关性

2.5 影响房颤合并缺血性脑卒中预后的危险因素分别以房颤合并缺血性脑卒中患者预后是否良好(是为1，否为0)为因变量，miR-221、MIF及TM为自变量，经多因素Logistic回归分析结果显示，miR-221、MIF、TM是房颤合并缺血性脑卒中的危险因素(P＜0.05)，见表5。

表5 影响房颤合并缺血性脑卒中预后危险因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

房颤是快速型心律失常之一，其中心房因为颤动可能失去有效的收缩节律，从而使泵血能力减低甚至丧失，增加淀粉沉积、心房纤维化、心房结构重构概率，最终导致心房增大。随着心房不断扩大，血液聚集，局部产生涡流，牵连内皮细胞受损，并刺激凝血机制，形成血栓[10]。而左心房血栓脱落引发的缺血性脑卒中是房颤中最为常见且严重的并发症，具备较高的致残率与病死率。相关数据显示，缺血性脑卒中占全部脑卒中的85%，是世界范围内第二位死亡原因[11]。若未能够尽早诊断并及时选择合理治疗方案，随着房颤合并缺血性脑卒中的持续发展，相应症状明显加重，给患者带来极大伤害，因此尽早准确诊断具有重要意义。目前临床多选择心电图、头颅CT等检查来诊断该疾病，虽然取得一定的应用价值，但其检出率较低，尤其是临床将房颤类型划分成阵发性与持续性两大类，其治疗方式存在较大差异，因此准确鉴别在治疗方案的抉择上具有重要作用[12]。近些年随着医疗水平的完善发展，研究发现miR-221、MIF、TM与房颤合并缺血性脑卒中的关系密切，若能够完全了解其相关性，可对临床治疗起到一定指导意义。

miR作为新型非编码小分子RNA，可在转录后防止基因表达，同时产生相关生物学作用，其中miR-221作为miR中常见类型。经动物实验发现，miR-221在脑卒中大鼠脑组织中表达升高，而减低miR-221可避免缺血脑组织出现炎性反应，还可降低脑组织缺血缺氧造成的损伤，提示miR-221与缺血性脑卒中的发生进展存在密切关联。研究发现，房颤患者存在较多表达失调的基因，mRNA、蛋白表达差异较大，从而使研究目标转变成miR这类新型基因表达调控因子，转录后水平能够对基因表达进行控制[13]。以往临床试验证实，房颤患者miR-221水平较正常者升高。本文研究发现，阵发性房颤组患者的miR-221水平明显低于持续性房颤组，差异有统计学意义，可能是因为持续性房颤患者病情更为严重，机体的炎性反应更显著，且脑组织缺血缺氧程度更严重，因此其表达较阵发性房颤患者更高。另外本次试验的结果显示，研究组的miR-221水平明显高出对照组、健康组。此结果与相关研究结果相符[14]，表明miR-221通过调控基因表达，能够使蛋白、mRNA表达差异变大，并通过影响胶原代谢，导致心房重构，引发房颤。同时炎性反应在房颤发生与发展中意义重大，一旦受到炎症、氧化应激等刺激后，可导致纤维细胞产生胞外基质，最终造成肌束间胞外基质过度堆积，为心肌纤维化奠定基础，增加房颤发生风险。

MIF作为结构特殊的多效免疫调节细胞因子，其主要是由T细胞、单核细胞、内皮细胞等表达，可刺激T淋巴细胞的关键性趋化因子。研究发现，缺血性脑卒中患者MIF水平高于健康者，提示其表达与疾病发生发展存在一定相关性。临床指出，健康者机体MIF水平通常处于2～4 μg/L，其分泌受到下丘脑-垂体的控制，呈现组成性表达，具备合成MIF能力的细胞将已经合成的MIF分子保存在细胞池内，一旦受到内毒素影响后分泌MIF，加上胞外各类蛋白酶的作用出现变化，使MIF展现生物学活性，积极参与机体的炎性反应中。本研究发现，研究组MIF水平明显高出对照组，而阵发性房颤组患者的MIF水平明显低于持续性房颤组。本研究结果与上述结论一致，表明MIF参与炎性反应导致心房重构，引起房颤。

TM是由内皮细胞合成，分布在血管内皮细胞表面的单链糖蛋白中，能够引导抗凝因子蛋白C快速活化，导致凝血酶底物出现特异性变化，积极参与机体抗凝反应，一旦血浆水平升高后，可促进血小板堆积，其表达与心脑血管疾病存在一定关联。研究发现，TM作为内皮细胞损伤的主要标志，一旦血管内皮细胞受损，TM可从细胞中分泌，进而提升其表达水平，因此房颤患者TM水平更高，尤其是持续性房颤患者[15]。本研究结果发现，研究组患者的TM水平明显高出对照组、健康组；阵发性房颤组患者的TM水平明显低于持续性房颤组。本研究结果与上述结果一致，表明TM通过提高表达水平，促进抗凝反应，从而使血小板堆积，心血管管径缩小，心脏负荷提升，导致心房重构，最终引起房颤。

最后本次研究中，预后良好组与预后不良组患者合并糖尿病、感染、高脂血症、高血压比例比较差异无统计学意义。预后良好组患者的年龄、女性、心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM水平明显低于预后不良组，通过多因素Logistic回归方程发现，miR-221、MIF、TM是房颤合并缺血性脑卒中的危险因素。Pearson相关性分析结果显示，心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM与房颤合并缺血性脑卒中呈正相关，提示影响患者预后的因素较多，应受到重点关注，尤其是老年、女性、心房增大、左房直径、射血分数、miR-221、MIF、TM水平异常者，尽早给予相关干预，为其预后提供保障。

综上所述，miR-221、MIF、TM水平在房颤合并缺血性脑卒中的发生发展中具有重要意义，同时可成为评估房颤发生与持续的新指标，为临床后续治疗方案的制定提供参考。