MARCH5对卵巢癌细胞糖代谢的调控作用研究

杜娟，何莉茹，王艳艳，王粉玲，金大永

1.西安市北方医院妇科，陕西 西安 710043；

2.西安市大兴医院影像科，陕西 西安 710016

肿瘤是一种基因病也是一种代谢病。近年来越来越多的研究表明，与正常细胞相比，肿瘤细胞的代谢特征发生了显著改变，即代谢重编程[1]。目前，细胞代谢重编程已被公认为是肿瘤细胞最重要的“十大特征”[2]。肿瘤细胞代谢重编程主要表现为三大营养物质糖、脂与氨基酸代谢的异常改变。其中，糖代谢重编程是发现最早、关注度最高的肿瘤细胞代谢特征[3]。肿瘤细胞糖代谢重编程于20世纪20年代由德国化学家Warburg首次报道，他发现肿瘤细胞在氧气充足时仍主要通过糖酵解而非氧化磷酸化的方式产生能量，该现象也被称为“瓦伯格”效应。此后，越来越多的研究在包括卵巢癌在内多种恶性肿瘤中证实了该现象的存在，并发现有氧糖酵解在肿瘤发生发展的各个阶段均发挥重要的促进作用[4]。然而目前，肿瘤有氧糖酵解增强背后的分子机制仍有待进一步阐明。

线粒体在细胞能量代谢调控中发挥核心作用[5-6]，其形态与功能受自身分裂与融合过程的精密调控[7-8]。研究发现，肿瘤细胞中多个线粒体分裂与融合蛋白存在表达与活性的异常变化，通过调控线粒体形态与功能促进肿瘤恶性进展[9-10]。膜相关锌指蛋白5(membrane-associated RING-CH 5，MARCH5)是线粒体定位的E3泛素连接酶，通过影响线粒体分裂蛋白表达而调控线粒体形态与功能[11]。卵巢癌中研究发现，MARCH5表达上调具有促进卵巢癌细胞侵袭与迁移的作用[12]，但作为线粒体定位的E3泛素连接酶，MARCH5是否调控肿瘤细胞代谢重编程仍不十分清楚。

本研究首次在卵巢癌细胞中分析MARCH5对细胞糖代谢的调控作用，包括糖酵解与线粒体氧化磷酸化。本研究将有助于加深对肿瘤细胞代谢重编程发生机制的认识，从而为肿瘤治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV3细胞购自中国科学院上海细胞库。小牛血清购自杭州四季青生物公司。葡萄糖与乳酸检测试剂盒均购自南京建成生物公司(货号分别为：F019-2-1与F006-1-1)、ATP含量检测试剂盒购自上海碧云天生物公司(货号：S0026)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养卵巢癌SKOV3细胞常规培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，细胞培养箱含5%浓度的CO2，温度为37℃。(1)siRNA合成与细胞转染：委托吉凯生物公司合成两条靶向MARCH5的siRNA干涉片段：干涉片段1(siMARCH5#1)序列为：5'-GCACUUGGGAGUAAUUUGA-3'；干涉片段2(si-MARCH5#2)序 列 为：5'-GCACACGUGUCCGAUUUAU-3'；阴性对照干涉片段(siCtrl)序列为：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。将合成好的siRNA干涉片段用脂质体lip2000为载体转染至卵巢癌SKOV3细胞内。(2)转染流程：首先，将3×105个SKOV3细胞接种至6孔板并培养过夜，分别用不含小牛血清的DMEM培养液稀释siRNA干涉片段与脂质体lip2000，随后将稀释好的siRNA与脂质体lip2000混匀并加入6孔板细胞中，细胞培养6 h更换含10%小牛血清的DMEM培养液继续培养24 h。

1.2.2 qRT-PCR实验采用OMEGA公司的RNA提取试剂盒(货号R6688)进行细胞总RNA提取，随后用购自TAKARA公司的反转录试剂盒(货号RR037A)将RNA反转录合成cDNA，随后进行MARCH5分子的mRNA表达检测。MARCH5引物序列为：F-5'-GTCCAGTGGTTTACGTCTTGG-3'；R-5'-CCGA-CCATTATTCCTGCTGC-3'。内 参β-actin引 物 序 列为：F-5'-TCGCCTTTGCCGATCCG-3'；R-5'-ATGATC-TGGGTCATCTTCTCG-3'。各组细胞MARCH5分子的相对mRNA表达计算用2-△△Ct法。

1.2.3 Western blot实验将含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液加入细胞，于冰上裂解30 min后离心收集上清。加入SDS上样缓冲液后煮沸5 min，随后于10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。将电泳分离的蛋白转印至PVDF膜，于5%的BSA中封闭1 h后加入稀释过的MARCH5抗体(Novus Biologicals，货 号NBP2-21583)与β-actin抗 体(Proteintech，货号20536-1-AP)。TBST溶液洗3次后加入稀释过的二抗，室温孵育1.5 h后用TBST洗3次。最后，加入发光液进行结果观察。

1.2.4 葡萄糖摄取实验分别于细胞培养0 h与12 h收集培养上清，用葡萄糖浓度检测试剂盒检测培养液中葡萄糖含量，培养0 h与12 h培养液中葡萄糖含量的差值代表细胞摄取利用的葡萄糖。葡萄糖浓度检测严格按试剂盒说明书进行，每个样品重复3个孔，最终结果用细胞蛋白浓度进行校准。

1.2.5 乳酸生成实验分别于细胞培养0 h与培养12 h收集细胞上清，用乳酸浓度检测试剂盒检测乳酸含量，培养0 h与12 h培养液中乳酸含量的差值代表细胞代谢分泌的乳酸。乳酸浓度检测严格按说明书进行，每个样品重复3个孔，最终结果用细胞蛋白浓度进行校准。

1.2.6 细胞氧气消耗速率检测采用德国汉莎公司的氧电极对细胞氧气消耗速率进行检测。大致检测流程：首先对电极进行清洁，设定实验反应温度为28℃，在无细胞的培养液体中建立零氧耗曲线，之后加入待测细胞进行氧耗检测，最终结果用细胞蛋白浓度进行校准。

1.2.7 ATP含量检测弃去细胞培养上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞两次，加入裂解液于冰上裂解细胞30 min，离心收集上清。用裂解液梯度稀释ATP标准品。将100 μL的ATP检测工作液与同体积的待测样品或梯度ATP标准品混合后加入96孔板，室温放置5 min后读取吸光值。最终结果用细胞蛋白浓度进行校准。

1.2.8 质谱检测糖酵解与线粒体三羧酸循环中间代谢产物首先，按以下流程制备样品：弃去细胞培养上清，用PBS清洗细胞两次，加入500 μL的纯水后于-80℃冷冻30 min，随后于37℃放置30 min进行融解，重复以上冷冻与融解步骤3次。用移液器收集上清，加入1.5 mL的甲醇，12 000×g离心10 min。收集上清并挥干后将样品送至上海中科新生命生物公司，用气象色谱与飞行时间质谱(GC-TOF-MS)平台对糖酵解与三羧酸循环中间代谢产物进行分析。最终结果用细胞蛋白浓度进行校准。

1.3 统计学方法应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析与LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干涉MARCH5抑制卵巢癌细胞的葡萄糖摄取与乳酸产生首先，将合成的两条靶向MARCH5的siRNA干涉片段转染入卵巢癌SKOV3细胞，转染24 h后提取细胞总RNA与蛋白，分别用qRT-PCR与Western blot实验检测转染siRNA干涉片段对MARCH5表达的干涉效率，结果发现：与对照组(siCtrl)SKOV3细胞相比，MARCH5干涉组1与干涉组2细胞的MARCH5表达在mRNA[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.02)∶(0.25±0.01)∶(0.23±0.01)，图1A]与蛋白水平[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(0.81±0.03)∶(0.25±0.01)∶(0.29±0.02)，图1B]均显著下调，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 转染siRNA干涉片段对卵巢癌SKOV3细胞中MARCH5表达的下调效率

随后，用商品化试剂盒检测细胞的葡萄糖摄取与乳酸产生后发现：与对照组(siCtrl)SKOV3细胞相比，转染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3细胞的葡萄糖摄取[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.06)∶(0.45±0.02)∶(0.44±0.02)，图2A]与乳酸产生[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.05)∶(0.36±0.02)∶(0.35±0.03)，图2B]均明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示下调MARCH5抑制了卵巢癌细胞的有氧糖酵解。

图2 干涉MARCH5对卵巢癌SKOV3细胞葡萄糖摄取与乳酸产生的影响

2.2 干涉MARCH5可促进卵巢癌细胞的氧化磷酸化进一步探讨干涉MARCH5表达对卵巢癌SKOV3细胞氧耗速率与ATP生成的影响，结果发现：与对照组(siCtrl)SKOV3细胞相比，转染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3细胞的氧气消耗速率[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(3.15±0.10)∶(5.73±0.14)∶(5.67±0.11)，图3A]与ATP生成均显著上调[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.04)∶(1.69±0.06)∶(1.74±0.07)，图3B]，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。表明下调MARCH5表达促进了卵巢癌细胞的氧化磷酸化。

图3 干涉MARCH5对SKOV3细胞氧气消耗速率与ATP产生的影响

2.3 干涉MARCH5可降低卵巢癌细胞内糖酵解中间代谢产物含量，而增加三羧酸循环中间产物含量用色谱质谱技术分析干涉MARCH5表达对卵巢癌SKOV3细胞中糖酵解与三羧酸循环主要代谢中间产物水平的影响，结果发现：与对照组(siCtrl)SKOV3细胞相比，转染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3细胞内糖酵解中间代谢产物葡萄糖[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.11)∶(0.47±0.04)∶(0.46±0.03)]、丙酮酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(0.61±0.03)∶(0.59±0.05)]与乳酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(0.36±0.02)∶(0.37±0.05)]水平均显著降低(图4A)，而三羧酸循环中间代谢产物柠檬酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.07)∶(2.60±0.08)∶(2.53±0.13)]、延胡索酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.04)∶(1.70±0.10)∶(1.67±0.08)]与苹果酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(2.15±0.08)∶(2.14±0.11)]水平均明显增多(图4B)，差异均有统计学意义(P＜0.05)。进一步表明干涉MARCH5具有抑制卵巢癌细胞糖酵解与激活氧化磷酸化的作用。

图4 干涉MARCH5对卵巢癌SKOV3细胞糖酵解与三羧酸循环主要中间产物的影响

3 讨论

新陈代谢是生命活动的基本形式，主要包括物质与能量代谢。正常情况下，细胞主要通过摄取外界环境中的葡萄糖与氧气，在线粒体中进行氧化磷酸化产生能量ATP，供给细胞生命活动所需[13]。当氧气缺乏时，细胞主要通过无氧糖酵解进行能量产生。大量研究发现，与正常细胞不同的是，肿瘤细胞即使在氧气充足时仍主要以糖酵解方式进行物质与能量代谢，该现象也被称为“瓦伯格”效应[14-15]。糖酵解不但为肿瘤细胞快速增殖提供了合成代谢的物质基础与能量ATP，同时也可通过产生乳酸，为肿瘤细胞的侵袭提供有利条件[16]。

当前，有氧糖酵解增强的机制始终是肿瘤代谢研究领域的热点话题。研究表明，癌基因激活与抑癌基因失活在促进肿瘤细胞糖酵解中发挥了重要作用。如研究发现，RAS与Myc等癌基因激活可通过转录上调糖酵解关键酶表达而激活细胞糖酵解，同时也可抑制氧化磷酸化关键调控蛋白表达而抑制线粒体的氧化磷酸化[17]。p53与PTEN等抑癌基因的失活也被证实可通过调控糖酵解与氧化磷酸化关键蛋白表达而促进肿瘤细胞的有氧糖酵解[18-19]。此外，细胞内多个代谢调控通路的激活也被证实促进了肿瘤细胞的有氧糖酵解，如研究发现，PI3K/AKT信号激活在肿瘤有氧糖酵解中扮演重要角色[20]。尽管上述研究已证实癌/抑癌基因及代谢相关信号通路在激活肿瘤细胞糖酵解中发挥重要作用。但目前，作为直接参与细胞物质与能量代谢调控的线粒体，其自身功能异常在肿瘤有氧糖酵解中的作用却极少被关注。

MARCH5线粒体外膜定位的E3泛素连接酶，以往研究发现MARCH5可通过调控线粒体分裂蛋白Mid49的泛素化与降解，而抑制线粒体分裂[11]。卵巢癌中研究发现，与正常卵巢组织相比，MARCH5表达在卵巢癌组织中显著升高，下调MARCH5表达可抑制卵巢癌细胞的迁移与侵袭[12]，表明MARCH5在卵巢癌发生发展中发挥重要作用。但作为线粒体定位的重要功能蛋白，MARCH5是否参与卵巢癌细胞糖代谢却尚不清楚。本研究首次在卵巢癌中证实，MARCH5在促进卵巢癌细胞糖代谢重编程中扮演重要角色，MARCH5发挥了激活糖酵解并同时抑制氧化磷酸化的作用。以往在胰腺癌中的研究证实，线粒体分裂调控蛋白DRP1介导的线粒体分裂可促进胰腺癌细胞的有氧糖酵解[21]。肝癌中研究也表明，线粒体分裂蛋白DRP1介导的线粒体延长可通过调控线粒体嵴结构而促进细胞的氧化磷酸化抑制糖酵解[22]。上述研究提示，MARCH5可能通过调控线粒体分裂融合蛋白泛素化与降解，进而调控线粒体形态与糖代谢重编程。然而，除线粒体分裂融合调控蛋白外，线粒体外膜上还分布着多个糖代谢调控蛋白，如丙酮酸转运蛋白MPC。当MPC表达降低时，细胞糖酵解产生的丙酮酸无法进入线粒体进行氧化磷酸化，只能在胞浆进一步代谢生成乳酸[23]。因此，MARCH5调控卵巢癌细胞糖酵解的机制仍有待今后用免疫共沉淀结合蛋白质谱等实验进一步探讨。

总之，本研究首次在卵巢癌细胞中证实了E3泛素连接酶MARCH5对有氧糖酵解的促进作用，有助于加深对卵巢癌细胞有氧糖酵解增强机制的认识，同时也将为肿瘤代谢治疗提供潜在靶点。