小鼠原代肝细胞的分离与培养

田守润，勾艳芳，王锦哲，樊芮伽，唐历波

1.海南医学院第二临床学院，海南 海口 570145；

2.海南医学院基础医学与生命科学院，海南 海口 570145

肝是机体中最大的消化腺，由肝细胞和多种不同种类的非实质细胞组成[1]，承担着重要的生理功能，肝细胞是肝组织的基本单位，占肝脏总质量的60%～80%[2]，是肝脏完成生理功能的基础[3]。肝细胞的原代培养具有一定的历史。目前，原代肝细胞分离提取方法主要有组织块法、胶原酶原位灌注法、Seglen两步胶原酶灌注法[4]。国内外应用最广的方法是Seglen两步灌注法[5]分离培养原代肝细胞，可分离成体肝组织细胞，为肝细胞分离培养的金标准，但步骤繁琐，一般实验室难于完成。王珊等[6]比较了3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能，寻找出了适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方，即：发现了小鼠原代肝细胞培养基中加入二甲基亚砜(DMSO)对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用，为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法。但是由于可重复性差以及个体差异性而无法全面推广。因此，如何找到一种简便且普及较好方法有待研究。小鼠肝细胞的分离培养与鉴定是肝组织工程的基础，在人工肝构建、体外药物测试模型构建以及3D打印可移植肝组织等方面具有重要作用。许多实验室在经典的两步法培养肝细胞的基础上不断简化优化培养方法[7-8]。本实验采用简单的胶原酶分离法，对培养的肝细胞克隆进行筛选，分离得到小鼠肝细胞克隆，免疫组化鉴定结果表明，利用简易胶原酶消化法可获得原代肝细胞，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器及材料高糖-DMEM培养基(Gibco公司，北京)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，布宜诺斯艾利斯，阿根廷)，12、96孔培养板(NUNC公司，丹麦)，小鼠抗大鼠CK-19荧光抗体(1∶10 BOSTER公司，美国)，WST-1试剂盒(Abcam公司，英国)，CO2培养箱(Thermo公司，美国)，倒置显微镜(Olympus公司，日本)，酶标仪(Thermo公司，美国)。实验材料为2～3日龄小鼠，雌雄不限，由海南医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝细胞分离培养方法将1日龄小鼠用70%酒精浸泡1 min消毒，移入超净台，在培养皿中，用眼科剪剪碎小鼠肝脏，生理盐水冲洗血液至组织发白，在冰浴条件下放置于预冷的磷酸盐缓冲(PBS)溶液中剪碎肝组织至匀浆状，PBS冲洗两次，加入3倍体积的0.1%胶原酶Ⅰ，37℃下消化1 h，加入含10%的胎牛血清(FBS)高糖DMEM培养液终止消化，吸管吹打成悬液200目筛网，1 000 r/min离心5 min，沉淀用培养液重悬，按104/mL的密度接种于培养瓶中。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。3 d后达80%密度时传代培养。

1.2.2 免疫化学染色鉴定小鼠肝细胞将培养3～4代的细胞收集，按106/mL浓度接种至小肠黏膜脱细胞基质膜上，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗3次，滴加CK-19荧光抗体室温下染色30 min倾去存留的荧光抗体，PBS清洗3次，在荧光显微镜下镜检观察。

1.2.3 细胞成活率及生长曲线测定0.4%台盼蓝拒染法检测分离肝细胞的成活率，倒置显微镜下进行细胞计数，统计未染色的活细胞占总细胞数的比例即为细胞成活率。细胞生长曲线测定：利用24孔板分别接种原代肝细胞，分别培养1～14 d，每个时间点取三孔弃去培养基，加入1 mL新鲜培养基加20 μL WST-1，培养2 h，每孔吸取180 μL至96孔板，在酶标仪中450 nm下得到吸光度值A450，该吸光度值与细胞增殖数成正比，从而得到肝细胞增殖曲线。

2 结果

2.1 小鼠原代肝细胞镜下观察初次分离的原代肝细胞呈卵圆形，核大，边缘清晰透亮(图1)，48 h后细胞开始贴壁生长，细胞变成长梭形(图2、图3)，5～7 d达到80%生长密度，细胞呈铺路石状排列(图4)。8 d后有死细胞产生并漂浮在培养液中。

图1 原代分离小鼠肝细胞(400×)

图2 48 h肝卵圆细胞贴壁生长(400×)

图3 贴壁生长肝细胞呈长梭形(400×)

图4 7 d肝细胞呈铺路石状排列(400×)

2.2 小鼠肝细胞原代培养成活率台盼蓝拒染实验表明，1 g小鼠肝脏可分离肝细胞1.2×105，原代分离活细胞比例为72%。

2.3 原代肝细胞生长特点通过生长曲线绘制可知，原代肝细胞贴壁生长后，有一个快速增长期，一般在5～7 d后达到增殖高峰，随后增殖能力逐渐下降(图5)，若继代培养，可恢复增殖能力，一般3～5代增殖能力最强。

图5 小鼠肝细胞生长曲线绘制

2.4 小鼠肝细胞与膜复合将3～5代肝细胞按1×106个/mL细胞浓度以滴加法滴注到猪小肠黏膜下层脱细胞基质膜(以下简称：SIS)，按0.1 mL/cm2将处于对数生长期的肝细胞与SIS复合，肝细胞在膜上能够分裂增殖(图6、图7)。免疫荧光染色表明，小鼠肝细胞可以在SIS膜上生长(图8)。

图6 肝细胞与SIS复合(40×)

图7 肝细胞在SIS上分裂增殖(40×)

图8 CK-19免疫荧光染色，示肝细胞在SIS膜上生长(40×)

3 讨论

中国是肝病大国，包括乙肝、肝癌、肝损伤等引发的急性肝衰竭威胁着人类的健康。分离培养肝细胞是肝组织工程及人工肝系统制备的基础。小鼠是模式生物，体外分离培养小鼠肝细胞在细胞生物学、毒理学、异种人工肝系统研制以及药理学等方面具有重要意义。肝细胞的分离培养方法多种多样，其中，经典的胶原酶两步灌流法是肝细胞分离培养的金标准[9]。但此法的缺点是所需胶原酶量大、成本高。一次性灌注消化一只成年大鼠肝脏需要75～100 mg胶原酶，浪费严重，而且需要蠕动泵[10-12]等，同时由于处理时间长，容易出现返流而造成培养污染，获得的分裂细胞为处于静息期的肝成体细胞，分裂传代能力有限，限制了该方法的广泛利用[13]。李素婷等[14]采用组织块方法分离培养小鼠肝组织细胞，肝细胞从组织块周边爬出，成活率较高，操作方法简单，但细胞爬出困难，数量有限，细胞培养周期长，难以形成细胞的群落效应。现阶段已发现的Wnt信号通路中有19种蛋白参与了细胞生长分化和胚胎形成及肿瘤发生过程[15]。彭利等[16]证实Wnt3a能够诱导HP14-19向成熟肝细胞分化。为肝细胞原代培养提供了又一新进展。因此，运用CK19免疫荧光可以鉴定肝细胞向成熟化分化的标志。本实验采用眼科剪在冰浴条件下剪碎肝组织，用胶原酶消化组织并释放出肝细胞，方法简单，不需要复杂的仪器设备，同时细胞存活率较高，适合于一般实验室分离培养肝细胞。但缺陷也是显而易见的：酶消化时间难以掌握，消化时间过长，容易造成细胞的损伤死亡，时间过短，细胞难以从组织中解离出来。本实验与经典的两步灌流法相比，虽然细胞纯度和细胞存活率都较低，但对普通实验室分离肝细胞是一个很好的选择方法。

新生小鼠肝组织含有多种类型细胞，血细胞会影响肝细胞的贴壁生长，在冰浴上剪碎组织块后通过简单的离心处理，即可分离脱除肝组织中的血细胞。眼科剪的剪切力会对部分细胞产生损伤作用，但剪切主要破坏细胞外基质，更有利于肝卵圆细胞从组织中释放出来。肝组织中细胞种类较多，包括各种类型肝干细胞、肝星形胶质细胞、造血干细胞以及间充质干细胞。分离纯化肝干细胞方法有许多种，包括物理机械分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法以及荧光流式细胞分选法。本实验采用物理机械分离法去除造血干细胞和间充质干细胞，利用贴壁快慢差异，并结合克隆筛选分离肝卵圆细胞，不断传代培养，杂细胞越来越少。利用CK-19免疫荧光染色证明分离到的克隆为肝卵圆细胞。

离体培养肝卵圆细胞具有接触抑制现象，并形成铺路石形状。而本实验将处于对数分裂期的肝细胞接种至SIS膜上，使细胞能够分裂生长并形成立体结构。细胞增殖实验表明，肝细胞在SIS膜上能够正常分裂并形成细胞克隆。细胞在膜上生长并在三维立体空间中建立相互联系是形成组织的前提，在骨组织工程研究中有一个“膜诱导再生理论”明确指出膜在形成组织中的作用[17]，而组织的形成本质上是细胞的有序行为。生命科学的一大基础难题就是有序性形成的机制，在分子水平，不同的生物大分子通过自组装或分子间相互作用形成功能性分子；在细胞水平，通过细胞间通讯形成有功能的组织；而在生物个体水平，通过信息的交流和控制实现了生物的社会性。因此，体外在膜上开展细胞间相互作用有助于揭示组织形成的奥秘。