外泌体源性microRNA-124对急性创伤性脊髓损伤大鼠脊髓小胶质细胞活化及炎症反应的影响*

高迎吉，朱中蛟，杨秀玲

（1.临沂市人民医院脊柱外科，山东临沂 276002；2.滕州市中心医院脊柱外科，山东滕州 277599；3.山东大学齐鲁医院肿瘤内科，山东济南 250012）

急性创伤性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）是一种突发性中枢神经系统创伤，可导致脊髓中血管破裂，神经元迅速死亡[1]。神经炎症是ASCI 重要的病理生理机制，其中小胶质细胞（Microglia, MG）发挥重要作用，活化MG 中的M1 型可释放炎症因子，M2 型可释放抑炎因子[2]。因此，促进ASCI 后M1 型MG 向M2 型转化是改善预后的重要措施。有研究发现，microRNA-124（miR-124）特异性表达于MG 中，上调其表达可促进M1 型MG 向M2 型转化，但裸露miR-124 易被降解，无法稳定地在中枢神经系统发挥作用，故探究可完整递送miRNA 的方式具有必要性[3]。外泌体（Exosomes,Exos）是一种由自体细胞分泌的纳米级囊泡样小体，通过转运RNA、生物活性磷脂、蛋白质等参与细胞与内环境的信号传递及物质运输，已逐渐用于递送载体、参与器官间联系及组织稳态维持[4]。本研究通过复制ASCI 大鼠模型，观察Exos 源性miR-124 对其脊髓MG 活化及炎症反应的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系、实验动物人源胚胎肾（human emborynic kidney, HEK）239 细胞系购自南京森贝伽生物科技有限公司。SPF 级SD 大鼠35 只，6 周龄，体重（200±20）g，购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2022-0004。

1.1.2 主要试剂miR-124-mimics 过表达质粒（上海汉恒生物科技有限公司），LipofectamineTM3000 试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司），Exos 提取试剂盒（上海贝博生物科技公司），兔抗人CD9、CD63 一抗，兔抗鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor 3, NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、P2X7 一抗、小鼠抗大鼠Iba-1、CD32、CD206 抗体（美国Abcam 公司），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器StepOne Puls 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国ABI 公司），JEM-2100Plus 透射电子显微镜（日本电子株式会社），Stat Fax-4200 酶标仪（美国Awareness 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染HEK239 细胞置于37℃、5%二氧化碳CO2、饱和湿度的DMEM 培养基中（含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、青霉素100 u/mL、链霉素100 μg/mL）。取对数期HEK239 细胞，PBS 洗涤，按1×105个/mL 接种至6 孔板，待细胞再次融合达75%，分为空白组、转染组。空白组不处理，转染组按照LipofectamineTM3000 试剂盒说明书步骤，转染miR-124-mimics 质粒。每组设置5 个复孔，每2 天更换1 次培养基，2～3 周后形成单克隆细胞系用于后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测转染后细胞miR-124、Exos源性miR-124、脊髓组织miR-124的表达取空白组、转染组细胞，用TRIzol 试剂提取总RNA，逆转录为cDNA，按照荧光定量试剂盒说明书操作，反应体系：双倍核酸染料12 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 2 μL，补充dd H2O 至总体积20 μL。反应条件：90℃预变性10 min，94℃变性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸25 s，共40 个循环。以U6为内参基因，2-ΔΔCt为目的基因相对表达强度，引物序列见表1。取空白组、转染组Exos，检测Exos 源性miR-124 相对表达量。取冷冻保存的脊髓组织，眼科剪剪碎，PBS 匀浆，注入离心管内，离心后取上清液，检测脊髓组织中miR-124 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 分离含miR-124 的Exos 并鉴定DMEM 培养基（含10%胎牛血清）12 000 r/min 离心15 h，取上清液。空白组、转染组细胞置于37℃、5% CO2、饱和湿度的DMEM 培养基中（含10%胎牛血清、1%青霉素）培养5 d。3 500 r/min 离心10 min，取上清液，采用Exos 提取试剂盒提取Exos，根据试剂盒说明书步骤进行操作。取Exos 10 μL，滴至载样铜网并静置2 min，去除浮液，1%磷钨酸溶液染色5 min，去除染液，自然晾干，在透射电镜下观察其形态。

1.2.4 Western bloting 检测空白组、转染组Exos 膜表面特异性标志蛋白的表达和脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白的表达取Exos 50 μL，加入裂解液50 μL（含蛋白酶抑制剂），4℃振荡25 min。离心取上清液，BCA 蛋白定量试剂盒定量，加入上样缓冲液，沸水浴变性5 min。每孔40 μg 上样，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭2 h，加入兔抗人CD9、CD63 一抗（1∶500），4℃孵育过夜，洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，洗涤、曝光、显影，凝胶成像系统分析，以CD9、CD63 与内参GAPDH 的灰度值比值表示蛋白相对表达量。

取冷冻保存的脊髓组织，操作方法同上，加入兔抗大鼠NLRP3、Caspase-1、P2X7 一抗（1∶500），检测脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相对表达量。

1.2.5 ASCI 大鼠模型的复制及分组腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，保持其俯卧体位，将T10椎体作为中心行矢状切口，显露T9～T11椎板，去除T10椎板和韧带，显露硬脊膜。采用纽约大学脊髓损伤打击器固定大鼠，将撞击棒（直径2.5 mm，重量10 g）从25 mm 位置自由下落撞击脊髓，自撞击棒下落到抬起时间间隔10 s。模型复制成功标准：脊髓被击打后表面迅速淤血、水肿，击打瞬间大鼠表现为后肢放射性迅速收回、抖动[5]。模型复制成功后清洗周围组织，常规缝合、抗感染。

从35 只大鼠中随机选取10 只仅咬除椎板显露脊髓，不进行损伤处理，设为假手术组，其余25 只复制ASCI 模型，模型复制成功20 只，随机分为ASCI 组、实验组，每组10 只。模型复制成功后24 h，实验组经尾静脉注射Exos 3×109个微粒（通过纳米颗粒跟踪分析仪Nanosight NS300 system 控制Exos量），假手术组及ASCI 组注射等量PBS 溶液[6]。

1.2.6 标本采集干预后3 d，颈椎脱臼法处死大鼠，于冰盘上迅速分离大鼠T9～T11节段脊髓，转移至EP 管中封闭保存，取5 只大鼠的脊髓组织-80℃冷冻保存，用于miR-124 相对表达量、MG 占比、脊髓组织炎症因子水平的检测，另外5 只大鼠的脊髓组织分成两份，一份固定于4%多聚甲醛24 h，另一份置入-80℃冰箱冷冻保存用于检测蛋白相对表达量。

1.2.7 流式细胞术检测脊髓组织MG 占比取脊髓组织，胰蛋白酶消化后离心，经密度梯度离心法分离出单个核细胞，用10%胎牛血清重悬，在单核细胞悬液中加入小鼠抗大鼠Iba-1、CD32、CD206 抗体，避光孵育30 min，离心弃上清液，PBS 洗涤，1%多聚甲醛定容，300 目细胞滤网过滤，4℃遮光保存，以阴性对照管设门，采用多参数流式细胞术检测定脊髓组织MG 中Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比。

1.2.8 ELISA 检测脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8水平取冷冻保存的脊髓组织，匀浆后采用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8 水平，根据试剂盒说明书操作步骤，经酶标仪测定570 nm 波长处吸光度值，画出曲线，计算样本浓度。

1.2.9 苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察脊髓组织病理学变化取脊髓组织切片，常规水化，冲洗，苏木精染液染色5 min，冲洗，分化液分化，冲洗，蓝化液反蓝，伊红染色2 min，漂洗，常规脱水、透明，滴入中性树脂封固，显微镜下观察脊髓组织病理学变化。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞转染后miR-124相对表达量比较

空白组与转染组miR-124 相对表达量分别为（0.95±0.12）和（2.38±0.27），经t检验，差异有统计学意义（t=10.822，P=0.000），转染组高于空白组。

2.2 Exos形态

透射电镜观察结果显示，Exos 膜结构完整，大小不一，大部分呈杯形或圆形，直径30～100 nm，与Exos 特征相符。见图1。

图1 透射电镜观察Exos形态 （×70 000）

2.3 含miR-124的Exos鉴定结果

空白组与转染组CD9、CD63 蛋白及miR-124相对表达量的比较，经t检验，差异均有统计学意义（P＜0.05），转染组CD9、CD63 蛋白及miR-124相对表达量升高。见表2 和图2。

表2 两组细胞CD9、CD63 蛋白、miR-124 相对表达量比较 （±s）

表2 两组细胞CD9、CD63 蛋白、miR-124 相对表达量比较 （±s）

组别空白组转染组t 值P 值CD9蛋白0.38±0.04 0.67±0.07 8.043 0.000 CD63蛋白0.32±0.04 0.61±0.08 7.250 0.000 miR-124 1.22±0.18 2.57±0.29 8.844 0.000

图2 空白组、转染组CD9、CD63蛋白的表达

2.4 3 组大鼠脊髓组织miR-124 相对表达量比较

假手术组、ASCI 组、实验组大鼠脊髓组织miR-124 相对表达量分别为（1.02±0.17）、（1.04±0.15）、（2.10±0.34），经方差分析，差异有统计学意义（F=34.287，P=0.000）。进一步两两比较结果：与假手术组、ASCI 组比较，实验组脊髓组织miR-124 相对表达量升高（P＜0.05）；假手术组与ASCI 组脊髓组织miR-124 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 3组大鼠脊髓组织MG占比比较

假手术组、ASCI 组、实验组大鼠脊髓组织Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，ASCI 组脊髓组织Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比均升高（P＜0.05）；与ASCI 组比较，实验组脊髓组织Iba-1＋/CD32＋占比降低（P＜0.05），Iba-1＋/CD206＋占比升高（P＜0.05）。见表3。

表3 3组大鼠脊髓组织MG占比比较 （n=5，%，±s）

表3 3组大鼠脊髓组织MG占比比较 （n=5，%，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与ASCI组比较，P ＜0.05。

组别假手术组ASCI组实验组F 值P 值Iba-1＋/CD206＋25.47±4.21 39.65±5.07①54.87±6.39②38.484 0.000 Iba-1＋/CD32＋20.19±3.57 44.28±5.31①29.36±4.92②34.039 0.000

2.6 3组大鼠脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8水平比较

假手术组、ASCI 组、实验组大鼠脊髓组织TNFα、IL-6、IL-8 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，ASCI 组脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高（P＜0.05）；与ASCI 组比较，实验组脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平降低（P＜0.05）。见表4。

表4 3组大鼠脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（n=5，±s）

表4 3组大鼠脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-8水平比较（n=5，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与ASCI组比较，P ＜0.05。

组别假手术组ASCI组实验组F 值P 值IL-8/（ng/mL）79.63±10.25 156.38±19.64①129.97±16.69②29.643 0.000 TNF-α/（ng/mL）4.21±0.96 7.59±1.12①6.23±0.74②15.930 0.000 IL-6/（pg/mL）106.85±12.68 179.74±23.57①142.28±19.96②17.878 0.000

2.7 3组大鼠脊髓组织病理学改变

假手术组大鼠脊髓组织未观察到明显的炎症细胞浸润。ASCI 组可观察到大量炎症细胞浸润，表现为典型的“血管袖套样”，且部分炎症细胞浸润至脑实质中。实验组血管周围与脑实质中有炎症细胞浸润，但不及ASCI 组炎症细胞数量多，程度较轻。见图3。

图3 3组大鼠脊髓组织病理切片 （HE染色×200）

2.8 3组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相对表达量比较

假手术组、ASCI 组、实验组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与假手术组比较，ASCI 组脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与ASCI 组比较，实验组脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表5 和图4。

表5 3组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相对表达量比较 （n=5，±s）

表5 3组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相对表达量比较 （n=5，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与ASCI组比较，P ＜0.05。

组别假手术组ASCI组实验组F 值P 值P2X7 0.25±0.03 0.92±0.11①0.40±0.05②119.645 0.000 NLRP3 0.35±0.04 0.72±0.08①0.53±0.06②44.267 0.000 Caspase-1 0.29±0.03 0.99±0.12①0.62±0.07②91.064 0.000

图4 各组大鼠脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白的表达

3 讨论

ASCI 引发的局部病理损伤表现为区域性、不完全性，并造成血管痉挛、局部炎症、组织水肿缺血、离子失衡、代谢紊乱及氨基酸毒性等复杂级联反应，进而损伤神经细胞并致其脱髓鞘，生成胶质瘢痕影响轴突正常生长，最终导致不可逆性神经功能损害[7-8]。MG 广泛分布于神经系统，其作为巨噬细胞具有呈递抗原、吞噬病原体、为神经元提供营养支持等作用，与炎症产生关系密切。ASCI 后中枢系统感受到强烈刺激，MG 转变为M1、M2 两种极化类型，M1 型通过分泌蛋白酶、炎症因子等加剧脊髓损伤，并诱导炎症细胞迁移至损伤区域，而M2 型可分泌抗炎因子从而减轻炎症反应及组织损伤[9]。由此可见，活化MG 在调控ASCI 后的炎症反应中占据重要地位。

miR-124 被证实大量表达于哺乳动物脑及脊髓神经元中，在癫痫、帕金森病及脑缺血等中枢神经系统疾病中起关键作用，并可促进MG 从促炎M1 型转化为抑炎M2 型[10-12]。李昊天等[13]发现，上调miR-124 可抑制脊髓损伤大鼠氧化应激导致的神经元凋亡，减轻脊髓损伤，提示其在治疗脊髓损伤方面的潜能。将Exos 作为将miR-124 输送至中枢神经系统的载体与自然生理学状态更为接近，且体积微小、容易获取及保存、无免疫排斥、免疫原性低。此外，该基因修饰方式可促进Exos 表面表达特定的受体和配体，从而使其具有结合特定细胞的功能。杨永祥等[14]研究发现，Exos 源性miR-146a 可提高N9 型MG 中miR-146a 相对表达量，进而调控下游靶向因子抑制N9 型MG 介导的炎症反应，表明Exos 可作为将miRNA 递送给受体细胞的有效载体。本研究结果显示，与ASCI 组比较，实验组脊髓组织Iba-1＋/CD32＋占比降低，Iba-1＋/CD206＋占比升高，且TNFα、IL-6、IL-8 水平降低，提示Exos 源性miR-124 可促进ASCI 大鼠脊髓M1 型MG 转化为M2 型，从而减轻脊髓炎症反应。

NOD 样受体是机体重要的模式识别受体，NLRP3 是其中主要类型之一，被激活后与Caspase-1、ASC 组成炎症小体。NLRP3 炎症小体是一种可激活炎症反应的多蛋白复合物，在先天性免疫及炎症相关疾病进程中发挥重要作用，可响应微生物感染与细胞损伤，具有抗微生物及免疫调节作用，通过介导Caspase-1 激活和促炎TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子分泌，导致细胞焦亡[15-16]。ZHAO 等[17]发现，通过抑制NLRP3 炎症小体激活、调节巨噬细胞极化可有效减少神经胶质瘢痕形成并促进轴突生长，从而治疗急性脊髓损伤，提示NLRP3 炎症小体可作为脊髓损伤治疗中的有效靶点。本研究结果显示，与假手术组比较，ASCI 组脊髓组织NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相对表达量升高，经实验组干预后均有所降低，提示P2X7-NLRP3/Caspase-1 信号通路在ASCI中被异常激活，Exos 源性miR-124 可能通过抑制该通路活性发挥治疗ASCI 的作用。

综上所述，Exos 源性miR-124 可促进ASCI 大鼠脊髓M1 型MG 转化为M2 型，减轻炎症反应，推测其作用机制与抑制P2X7-NLRP3/Caspase-1 信号通路活性有关。