脱落酸通过提高抗氧化酶活性与基因表达参与富氢水增强番茄幼苗抗旱性

闫 梅，姚彦东，牟开萍，淡媛媛，李伟泰，廖伟彪

(甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州 730070)

氢气(H)作为一种新型气体信号分子参与植物的生长发育过程。Zhu等观察到H可促进黄瓜不定根发生。同样地，研究发现，50%富氢水(HRW)处理可显著增加黄瓜幼苗的株高、茎粗、鲜重和叶面积。此外，H还可响应植物非生物胁迫，并在植物抵御逆境胁迫中发挥重要作用。Chen等研究表明，H可缓解黄瓜在干旱胁迫下诱导的氧化性损伤和植物生长抑制。脱落酸(ABA)是一种存在于植物体内的具有倍半萜结构的内源植物激素，具有抑制细胞分裂，促进叶和果实衰老和脱落等作用。研究表明，ABA作为一种胁迫响应因子参与多种非生物胁迫响应。在干旱胁迫下，60 μmol·LABA处理可通过降低细胞膜透性，提高过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)及谷胱甘肽还原酶(GR)活性来增强猕猴桃的抗旱性。

目前，关于H和ABA参与响应植物非生物胁迫方面已有文献报道，但关于两者关系鲜有报道。在拟南芥中，外源ABA可诱导H的产生和释放，而外源HRW则有效地提高了细胞内H的产量，促进气孔关闭，从而增强拟南芥的抗旱性。随后，Jin等研究发现，H可通过ABA影响紫花苜蓿叶片的质外体pH和气孔关闭。而关于H和ABA在响应胁迫中的作用及关系鲜见文献报道，尤其是关于两者缓解植物干旱胁迫的机制和相互关系有待进一步揭示。因此，本试验以番茄(L. cv. Micro-Tom)为试材，用PEG模拟干旱胁迫，研究外源HRW和ABA对干旱胁迫下番茄幼苗的影响及两者的关系，为研究H和ABA调控植物抗旱提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验所用的番茄品种为Micro-Tom，购于海明公司。取适量籽粒饱满、大小一致的Micro-Tom番茄种子用5%的次氯酸钠消毒10 min，后放入温水中浸泡6 h，在滤纸含无菌蒸馏水的培养皿中萌发。将萌发的番茄种子种于带有湿润滤纸的培养皿，2 d后将幼苗种植于1/2 Hoagland营养液中，7 d后更换为全Hoagland营养液，每7 d更换一次营养液，更换3次后选择整齐、大小一致的健壮幼苗进行后续处理。参照Khanzada等的方法选取聚乙二醇6000(PEG-6000)模拟干旱浓度为15%；配置成浓度为50 μmol·L的氟啶酮(FLU，ABA合成抑制剂)溶液进行叶面喷施。HRW浓度筛选设置6个处理，每个处理3个重复，分别为对照(CK)、PEG、25%、50%、75%、100%(HRW 根施)；ABA浓度筛选设置6个处理，每个处理3个重复，分别为对照(CK)、PEG、50、100、150、200 μmol·L(ABA叶面喷施)。从以上处理中筛选出抗旱性较好的最适HRW和ABA浓度后；接下来的试验中HRW和ABA单独或者共同使用，即对照(CK)、PEG、PEG+HRW、PEG+ABA、PEG+HRW+ABA、PEG+HRW+FLU和FLU；处理6 d后，在上午9：00—10：00采集各处理植株第3、4功能叶片用于后续试验指标的测定，重复3次，求平均值。生长室光照强度为200 μmol·m·s，白天(25±2)℃保持14 h，夜间(20±2)℃保持10 h。

1.2 富氢水的制备

使用本实验室的制氢仪(QL-300，赛克赛斯)制备饱和氢气。H以300 mL·min的流速在装有1 L蒸馏水的容量瓶中持续通入30 min，即可得到饱和的富氢水(HRW)。在本试验中用便携式测氢仪(Trustlex Co；Led，ENH-1000，日本)测定表明，HRW中H的浓度为0.45 mmol·L。

1.3 指标测定

在试验6 d结束时分别采用直尺和游标卡尺测量株高和茎粗，用分析天平称量鲜重和干重。ABA含量测定采用高效液相色谱法，ABA的提取参照张玉琼等的方法，略有改动。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定，过氧化氢酶(CAT)活性用紫外吸收法测定，抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性是通过记录抗坏血酸在290 nm处的氧化速率来测定。

用TaKaRa植物总RNA抽提纯化试剂盒提取总RNA，之后以总RNA为模板，采用宝生物反转录试剂盒合成cDNA。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测、、和的基因表达量。以番茄作为内参基因，反应体系为20 μL：2 μL cDNA，上下游引物共2 μL，10 μL 2×SYBR Green Master Mix SYBR，6 μL ddHO。引物序列如表1所示，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，50个循环；反应结束后72 ℃延伸10 min。基因相对表达水平用2-ΔΔC方法进行分析。

表1 实时荧光定量引物序列

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据处理、制图，采用Duncan检验对各处理间的差异显著性进行分析(<0.05)。

2 结果与分析

2.1 H2对干旱胁迫下番茄幼苗生长的影响

从图1可见，PEG处理对番茄幼苗株高、茎粗、鲜重和干重的增长具有显著的抑制作用，主要表现为PEG处理的番茄幼苗株高、茎粗、鲜重和干重显著低于对照。干旱胁迫下，25%、50%、75%和100% HRW处理6 d的番茄幼苗株高显著高于PEG处理，其中75% HRW处理的番茄幼苗株高较PEG处理最显著，较PEG处理显著增加13.3%(图1-A)。干旱胁迫6 d后，25%、50%和100% HRW处理的茎粗与PEG处理无显著差异，而75% HRW处理的茎粗显著大于PEG处理。与PEG处理相比，25%和75% HRW处理的番茄幼苗鲜重和干重显著增加，其中75% HRW处理的干重较PEG处理显著增加了20.8%(图1-B)。因此，75% HRW作为提高番茄幼苗抗旱性的最适浓度用于后续试验。

同一指标不同处理间没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。The bars of the same index with different letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.图1 富氢水对干旱胁迫下番茄幼苗生物量的影响Fig.1 Effect of hydrogen-rich water on tomato seedlings biomass under drought stress

2.2 ABA对干旱胁迫下番茄幼苗生长的影响

如图2所示，与对照相比，PEG处理的番茄幼苗株高、茎粗、鲜重及干重显著降低。在干旱胁迫下，100、150和200 μmol·LABA处理的番茄幼苗株高显著高于PEG处理，而50 μmol·LABA处理与PEG处理差异不显著；50、100和150 μmol·LABA处理的番茄幼苗茎粗显著高于PEG处理。其中150 μmol·LABA是提高干旱胁迫下番茄幼苗株高和茎粗的最佳处理，较PEG处理分别增加11.2%和15.8%(图2-A)。在干旱胁迫6 d后，100、150和200 μmol·LABA处理的番茄幼苗鲜重显著高于PEG处理，而50 μmol·LABA处理与PEG处理差异不显著；150 μmol·LABA处理的干重显著高于PEG处理，比PEG处理高20.8%，而50、100和200 μmol·LABA处理与PEG处理无显著差异(图2-B)。因此，150 μmol·LABA用于后期试验。

图2 脱落酸对干旱胁迫下番茄幼苗生物量的影响Fig.2 Effect of ABA on tomato seedlings biomass under drought stress

2.3 HRW、ABA及ABA抑制剂FLU对干旱胁迫下番茄幼苗生长的影响

由图3可知，相比于对照，PEG处理显著抑制番茄幼苗的生长。与PEG处理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA处理均缓解了干旱胁迫对番茄幼苗生长的抑制，其株高、茎粗、鲜重和干重显著增加。干旱胁迫6 d后，HRW处理的同时喷施ABA抑制剂FLU，抑制了HRW对番茄幼苗生长的缓解作用，番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重比PEG+HRW处理分别下降了8.7%、17.3%、13.5%和16.7%。HRW单独处理较对照显著增加番茄幼苗的株高和鲜重；FLU单独处理与对照相比，显著降低番茄幼苗的株高、茎粗和鲜重(图3)。

图3 不同处理对干旱胁迫下番茄幼苗生物量的影响Fig.3 Effect of various treatments on tomato seedlings biomass under drought stress

2.4 干旱胁迫下HRW对番茄幼苗ABA含量及其合成酶相关基因表达的影响

如图4所示，在胁迫和非胁迫条件下，外源HRW处理显著增加了番茄幼苗内源ABA含量及相对表达量，其中HRW和PEG+HRW处理无显著差异。HRW单独或胁迫下处理的内源ABA含量较对照分别增加了173.0%和164.5%；相对表达量较对照分别上调了227.0%和300.0%。与对照相比，PEG处理显著增加了番茄幼苗内源ABA含量及相对表达量。PEG+HRW处理的番茄幼苗叶片内源ABA含量以及基因表达水平较PEG处理分别提高了17.8%和139.5%。

图4 HRW处理对干旱胁迫下番茄幼苗ABA含量及关键酶基因表达的影响Fig.4 Effect of HRW treatments on ABA content and gene expression of key enzymes in tomato seedlings under drought stress

2.5 HRW、ABA及ABA抑制剂FLU对干旱胁迫下番茄幼苗叶片丙二醛含量的影响

由图5可知，干旱胁迫下MDA含量较对照显著增加了76.9%。与PEG处理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA处理的番茄幼苗叶片MDA含量分别降低了34.8%、32.6%和37.0%，但3个处理之间没有显著差异。PEG+HRW+FLU处理的番茄幼苗叶片MDA含量较PEG+HRW处理显著增加了16.7%。HRW和FLU单独处理下番茄幼苗叶片MDA含量略有下降，但与对照相比无显著差异。

图5 不同处理对干旱胁迫下番茄幼苗丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of various treatments on malondialdehyde content of tomato seedlings under drought stress

2.6 HRW、ABA及ABA抑制剂FLU对干旱胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响

如图6所示，干旱胁迫下番茄幼苗叶片SOD、CAT、APX的活性显著高于对照，HRW和FLU单独处理的番茄幼苗叶片的SOD和APX活性较对照差异不显著。干旱胁迫6 d后，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA处理的番茄幼苗叶片SOD和CAT活性显著高于PEG处理，而PEG+HRW+FLU处理的SOD和CAT活性最低。与PEG处理相比，PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA处理的番茄幼苗叶片APX活性分别增加了25.4%、34.1%和40.8%。在PEG+HRW处理时喷施FLU可以显著降低番茄幼苗叶片APX活性，较PEG+HRW处理降低了76.7%(图6)。

图6 不同处理对干旱胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.6 Effect of various treatments on antioxidant enzyme activity of tomato seedlings under drought stress

2.7 HRW、ABA及ABA抑制剂FLU对干旱胁迫下番茄幼苗抗氧化酶基因表达的影响

图7表明，与对照相比，干旱胁迫下番茄幼苗叶片、和基因表达量显著上调，分别为对照的98.0%、27.0%和73.0%。PEG+HRW、PEG+ABA和PEG+HRW+ABA处理的番茄幼苗叶片、和基因表达量较PEG处理显著上调，但3个处理之间无显著差异。与PEG+HRW处理相比，PEG+HRW+FLU处理的、和基因表达量显著下调，较PEG+HRW处理分别下调了74.7%、73.7%和71.0%。HRW和FLU单独处理的番茄幼苗叶片和基因表达量与对照相比无显著差异(图7)。

图7 不同处理对干旱胁迫下番茄幼苗抗氧化酶基因表达的影响Fig.7 Effect of various treatments on the expression of antioxidant enzyme genes of tomato seedlings under drought stress

3 讨论

H作为植物抵御逆境的重要生物调节因子，在调节干旱胁迫中发挥着重要的作用。在本试验中，HRW浓度为75%时可显著增加干旱胁迫下番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重，进而促进干旱胁迫下番茄幼苗的生长(图1)。Xie等报道，HRW处理通过减少气孔开度来增强拟南芥对干旱胁迫的耐受性。与PEG处理相比，PEG+50% HRW处理可促进干旱胁迫下黄瓜不定根的发生。ABA是一种重要的植物激素，参与植物生长发育过程和胁迫响应。本试验研究发现150 μmol·LABA显著提高了干旱胁迫下番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重(图2)。本研究结果与Zhang等研究结果相似，他们发现干旱胁迫下施加外源ABA处理可显著增加大豆幼苗的株高、茎粗、第一节间长和分枝数。此外，本研究还发现干旱胁迫下外源HRW和ABA共处理可增加干旱胁迫下番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重；而与PEG+HRW处理相比，PEG+HRW+FLU处理显著降低了番茄幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重(图3)。说明H促进干旱胁迫下番茄幼苗的生长可能需要ABA的参与。干旱胁迫可诱导紫花苜蓿ABA的合成，而H处理可显著增加在干旱或非干旱胁迫下内源ABA含量及合成基因的表达。这些结果与本研究结果一致，本试验结果表明，干旱胁迫下番茄幼苗内源ABA含量和基因表达量较对照显著增加，且外源HRW处理能显著增加干旱胁迫下番茄幼苗内源ABA含量和基因表达(图4)。这些结果说明H可能参与诱导干旱胁迫下ABA的合成。

MDA作为膜脂过氧化最重要的产物之一，其累积可加剧膜的损伤。因此，可通过测定MDA含量了解膜脂过氧化的程度和植物的抗逆性。结果显示，在干旱条件下，番茄幼苗叶片中的MDA含量显著上升，这与Yuan等的研究结果一致。本试验发现，外源HRW和ABA处理可显著降低干旱胁迫下番茄幼苗叶片中的MDA含量，从而降低干旱胁迫对番茄幼苗造成的脂质过氧化程度，保护干旱胁迫下番茄幼苗的细胞膜(图5)。祝长龙等研究发现，外源ABA处理可以抑制干旱胁迫下美国红枫的MDA积累，这与我们的研究结果一致。此外，本试验研究发现，在干旱胁迫下HRW和ABA共处理的MDA含量减少量比HRW或ABA单独处理多，但是这种作用被FLU逆转。目前，关于H和ABA共处理缓解干旱胁迫的机制还不够清楚。本研究结果表明，ABA可能通过降低MDA含量参与H增强番茄幼苗的抗旱性。

研究报道，在缓解紫花苜蓿镉胁迫中，H提高了SOD、POD和APX等酶活性。Li等发现，H可以通过增加抗氧化酶活性来发挥抗氧化保护作用，正向调节ABA依赖的干旱响应。本试验研究结果也表明，HRW处理能够显著增加干旱胁迫下番茄幼苗的SOD、CAT和APX活性(图6)。在干旱胁迫第6和8天，ABA处理可显著增加三倍体百慕大草的SOD、CAT和POD活性。这些结果与本研究结果一致，即干旱胁迫下外源ABA可显著提高番茄幼苗的SOD、CAT和APX活性。此外，本研究进一步发现，干旱胁迫下HRW和ABA共处理的番茄幼苗叶片SOD、CAT和APX活性高于HRW或ABA单独处理。但是，HRW缓解干旱胁迫的作用被FLU抑制。因此，本研究结果表明ABA可能通过提高番茄幼苗的抗氧化酶活性来参与H响应干旱胁迫。

在干旱胁迫下，与对照相比，番茄幼苗叶片中的、和基因表达显著上调。这与李州等的研究结果一致，即在轻度水分胁迫下，白三叶的、和基因表达量比对照显著上调。本研究发现，与PEG处理相比，干旱胁迫下，外源HRW处理显著上调了番茄幼苗、和基因表达量(图7)。Xu等也研究表明，HRW处理可通过提高SOD、CAT和APX活性和相应的基因表达来缓解盐胁迫对水稻种子萌发的抑制。本试验进一步研究发现，PEG+ABA处理能够显著增加干旱胁迫下番茄幼苗叶片中的、和基因表达。Guo等研究表明，外源ABA能够显著增加低温胁迫下辣椒叶片中SOD、POD活性及相应的基因表达。此外，本研究发现，在干旱胁迫下HRW和ABA共同处理的、和等基因表达高于HRW 或ABA单独处理；而HRW对上述基因表达的促进作用被FLU逆转。因此，本研究结果表明，H上调、和基因表达量来增强番茄幼苗的抗旱性可能需要ABA参与。

综上所述，ABA参与H增强番茄幼苗的抗旱性可能是通过促进干旱胁迫下番茄幼苗叶片ABA的合成、抑制MDA的积累以及上调、和的基因表达量，进而增加了干旱胁迫下SOD、POD和APX的活性，有效缓解了干旱胁迫对番茄幼苗造成的氧化性伤害，稳定细胞膜结构。因此，本试验为阐明H和ABA在响应胁迫中的关系及机制提供了理论依据。