外源褪黑素对低温弱光胁迫下辣椒叶绿素荧光和抗氧化系统的影响

丁东霞，李能慧，李 静，唐超男，王 成，牛天航，杨 滟，杨海涛，颉建明

(甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州，730070)

光照和温度是植物生长发育的两个重要环境因子，对植物的分布和生长发育调控起重要作用。辣椒原产南美洲，喜温喜光，是我国设施栽培的主要蔬菜之一。然而，西北地区冬春季节的日光温室栽培中低温经常伴随弱光出现，低温弱光是反季节辣椒的生产限制关键因子，严重影响辣椒产量和品质。研究表明，低温弱光导致辣椒叶片叶绿素和净光合速率的降低，丙二醛(MDA)含量显著增加和细胞膜透性增大。近年来，中国设施蔬菜规模稳定的递增，2018年设施总面积为189.42万hm。因此，提高设施辣椒对低温弱光胁迫的抗性成为辣椒早春栽培亟待解决的问题。

褪黑素(melatonin，MT)是广泛存在于生物体内的一种激素，最早发现于松果体内，其化学名为-乙酰基-5甲氧基色胺。褪黑素被认为是一种生长调节剂，参与调控植物的多个生物过程，包括种子萌发、根系生长、开花、衰老等。除此之外，褪黑素还具有维护细胞膜结构、清除活性氧、提高植物抗性的功能，参与一系列生物和非生物胁迫，如干旱胁迫、高温胁迫、冷害胁迫、盐胁迫、病害等。有研究表明，外源喷施一定浓度的褪黑素可以有效缓解低温弱光对茄子幼苗的胁迫伤害，提高可溶性糖和脯氨酸含量，降低茄子幼苗叶片中电解质渗透率和MDA含量，有效减轻低温弱光对细胞膜的破坏性，提高茄子的抗逆性；黄陈珏等研究表明，当外源褪黑素浓度范围为50～100 μmol·L时可以提升越冬茬樱桃番茄果实品质；100 μmol·L的外源褪黑素预处理可以增强油菜幼苗对低温的适应性；缓解低温胁迫对玉米幼苗的伤害。除此之外，外源褪黑素在烟草、甜瓜、牡丹和月季等作物中的作用也有研究。但迄今为止，基于外源褪黑素作用的辣椒低温弱光的生理机制研究较少。本研究以辣椒幼苗为材料，主要研究不同浓度褪黑素促进辣椒幼苗耐低温弱光胁迫的作用机制，并筛选出缓解效果最佳的褪黑素浓度，为冬春季节设施辣椒栽培管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

本试验在甘肃农业大学农科楼园艺学院人工气候箱(RDN-400E-4，浙江宁波)进行。

1.2 试验材料

供试辣椒为陇椒10号(甘肃地区主栽品种)，购自甘肃省农业科学院；褪黑素(≥98%)购自Sigma公司。

1.3 试验设计

将籽粒饱满的陇椒10号辣椒种子消毒后，置于28 ℃恒温黑暗条件下催芽，待种子露白后播种在装有基质(草炭∶蛭石∶珍珠岩体积比3∶1∶1)的塑料营养钵中(9 cm×9 cm)，每个营养钵2粒种子，正常温光管理(28 ℃/18 ℃，300 μmol·m·s)。待幼苗长至5～6片真叶时，选择长势一致的植株进行褪黑素溶液处理。试验采用随机区组设计，设置6个不同浓度的褪黑素溶液，分别为0(T1)、50(T2)、100(T3)、150(T4)、200(T5)和250(T6)μmol·L，其中T1以等量蒸馏水替代，所有处理中均加入0.1%吐温；采用叶面喷施的方法，叶片正反面均匀喷施至水滴欲滴为止，于每晚8点进行叶面喷施，连续处理4 d。之后，转入人工气候箱进行低温弱光处理(温度为15 ℃/5 ℃，光照为100 μmol·m·s)，7 d后进行指标测定。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 叶绿素含量、叶绿素荧光参数测定

叶绿素含量测定参照李静的方法；叶绿素荧光参数测定参照胡琳莉的方法，并做稍微调整，使用调制叶绿素荧光成像仪IMAGIN-PAM(Heinz WaItz， Germany)进行测定。每处理随机选择3株重复，经过30 min暗适应之后，剪下第3片完全展开的功能叶，平展在荧光仪的测定台上，并用细线固定好。荧光仪检测参数设定为测量光光照强度0.1 μmol·m·s，光化光强度81 μmol·m·s，饱和脉冲光照强度2 700 μmol·m·s，脉冲光时间0.8 s，每20 s打一次饱和脉冲光，总共打15次，在AOI type中采用Polyon方式，沿着边缘手动选择全叶作为AOI，读取最后一次饱和脉冲光所测得的光适应下荧光参数值进行分析。

1.4.2 生理生化指标测定

可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法；丙二醛(MDA)含量的测定采用代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑法；细胞膜相对透性均参照高俊凤的方法测定；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用过氧化氢法；超氧阴离子含量测定使用苏州科明铭生物技术有限公司生产的超氧阴离子测定试剂盒。

1.4.3 叶片的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色

辣椒叶片NBT染色参照夏凌君的方法。取不同褪黑素浓度处理后的辣椒幼苗叶片，分别置于150 mL广口三角瓶中，量取50 mL NBT染液(0.5 mg·mL，用pH 7.8的PBS溶解)加入其中，抽真空30 min；然后25 ℃暗置孵育6 h；最后倒出染液，加入脱色液(乳酸∶甘油∶无水乙醇体积比为1∶1∶3)沸水浴5～6 min分钟，直至叶片中绿色完全褪去为止。用扫描仪扫描染色叶片并观察。

1.5 数据分析

使用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计与作图；试验数据的方差分析使用SPSS 20.0软件采用Duncan’s进行显著性分析(<0.05)；使用Photoshop CS6软件进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 不同浓度褪黑素处理对低温弱光胁迫下辣椒叶片光合色素含量的影响

如图1所示，与T1相比，喷施不同浓度的褪黑素均明显增加叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，且随着浓度的增加表现出先增加后下降的趋势。当褪黑素浓度为100 μmol·L时(T3)，辣椒幼苗叶片的叶绿素a、b和总含量均显著高于对照T1，分别增加了26.09%、24.55%、25.72%，其他处理间则没有显著差异，而类胡萝卜素含量则在T2(50 μmol·L)处理时较T1显著升高，其他处理较T1无显著差异。

不同处理间没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。The bars without the same letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.图1 不同浓度褪黑素处理对低温弱光胁迫下辣椒叶片光合色素含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on photosynthetic pigment content in pepper leaves under low temperature and low light stress

2.2 不同浓度褪黑素处理对低温弱光胁迫下辣椒叶片叶绿素荧光参数的影响

图2为不同褪黑素浓度处理后叶片PSⅡ最大光化学效率(/)的荧光成像图。低温弱光胁迫明显降低了/，但对叶脉影响较小；叶片喷施褪黑素后，随着褪黑素浓度增加伤害程度有所下降，但浓度大于200 μmol·L后，缓解效果有所下降。同时，由表1可知，喷施不同浓度褪黑素均显著增加了叶片的/，其中浓度在100 μmol·L(T3)时显著提高了辣椒叶片/，较T1增加了11.20%。T4、T5和T6则分别增加了9.83%、5.99%和6.20%。说明当褪黑素浓度较高时，对/下降的缓解作用减弱。

图2 不同浓度褪黑素对低温弱光胁迫下辣椒叶片Fv/Fm的影响Fig.2 Effects of different concentrations of melatonin on Fv/Fm of pepper leaves under low temperature and low light stress

由表1可知，低温弱光胁迫下外源喷施褪黑素处理时辣椒叶片的(Ⅱ)、和随着褪黑素浓度的增加表现出先增加后降低的变化趋势。而()、和则表现出相反趋势。其中T3处理的(Ⅱ)、和最大，且均与T1有显著性差异，分别增加了43.79%、36.99%和33.88%；而和除了与T4处理之间无显著性差异，与其他各处理均存在显著增加；(Ⅱ)则与所有处理相比均显著增加。非光化学猝灭的量子产量(())、非光化学猝灭系数()和非光化学猝灭()在T3处理时均最小，与T1相比分别显著降低了24.62%、32.74%和14.06%。其中的T3处理与其余各处理均有显著差异，而()和除了与T4无差异外，与其余处理均有显著差异。说明100 μmol·L的褪黑素浓度对辣椒低温弱光造成的伤害缓解效果最好。

表1 不同浓度褪黑素对辣椒低温弱光胁迫下叶绿素荧光参数的影响

2.3 不同浓度褪黑素对辣椒低温弱光条件下可溶性糖、MDA和叶片相对电导率含量的影响

图3-A为低温弱光下，不同浓度褪黑素处理对可溶性糖的影响，当褪黑素的浓度逐渐增大时，可溶性糖含量呈现先增加后降低的趋势，在T3处理时达到最大，较T1处理增加了52.88%，其他4个处理分别增加了19.21%、39.07%、8.75%和19.91%。在外源褪黑素处理下，辣椒幼苗MDA的含量较T1处理含量明显下降(图3-B)，随着褪黑素浓度的增加MDA含量先降低后增加，在T3处理时显著低于其他处理。与T1处理相比，各处理分别降低了20.49%、22.50%、18.18%、14.82%和2.54%。由此说明，褪黑素能降低低温弱光胁迫下辣椒叶片的MDA含量，T3处理时效果最好。

图3 不同浓度褪黑素处理对辣椒低温弱光条件下可溶性糖、MDA含量和相对电导率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of melatonin on soluble sugar， MDA content and electrical conductivity of pepper under low temperature and low light conditions

图3-C为不同浓度褪黑素处理对电导率的影响，在低温弱光胁迫下，低浓度的褪黑素处理有效降低了低温弱光胁迫下辣椒叶片的相对电导率，高浓度褪黑素(>150 μmol·L)处理增加了相对电导率。随处理浓度的增加，相对电导率呈先降低后升高再降低的趋势，其中T3处理时相对电导率较对照组显著下降，较T1处理降低了17.54%；T4、T5和T6处理较T1处理分别增加了8.94%、19.56%和3.02%。

2.4 不同浓度褪黑素处理对低温弱光胁迫下辣椒叶片超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性和超氧阴离子含量的影响

图4-A为低温弱光下，不同褪黑素浓度对SOD活性的影响，当褪黑素的浓度逐渐增大时，辣椒SOD活性呈先升高后降低再升高的趋势。T3和T6处理与T1有显著差异，低温弱光胁迫处理下SOD活性最低，为18.76 U·g；T3处理时的辣椒幼苗SOD活性达到最高，较T1增加了66.31%。 T6处理SOD活性增加次于T3处理，与T1相比增加了60.21%，可能是因为，高浓度(250 μmol·L)的褪黑素对辣椒造成了胁迫，激发了体内SOD的生成。T1与T2、T4和T5处理之间没有差异。如图4-B所示，CAT活性随着褪黑素浓度的增大呈逐渐增大的趋势，T3、T4、T5和T6与T1相比都显著增加，分别增加56.65%、69.81%、70.20%和83.95%，但是T3与T4、T5和T6处理之间没有差异。由图4-C可知，外源喷施褪黑素能够明显降低超氧阴离子的含量，且随着浓度的增加表现为先下降后升高的趋势，其中T3处理时超氧阴离子含量最低为52.76 nmol·g，较T1处理显著下降了48.40%。T3处理除了与T2处理无显著差异外，与其他处理均存在显著差异。

图4 不同浓度褪黑素对辣椒低温弱光胁迫下SOD、CAT活性和超氧阴离子含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of melatonin on SOD， CAT activity and superoxide anion content of pepper under low temperature and low light stress

图5为低温弱光下，不同浓度褪黑素处理对辣椒叶片超氧阴离子的影响，能够明显观察到与T1处理相比，外源喷施褪黑素后叶片颜色明显变浅，且随着褪黑素浓度的增大颜色表现为先变浅后有所加深，在T3处理的叶片染色最浅。

图5 不同浓度褪黑素处理对低温弱光胁迫下辣椒超氧阴离子的含量Fig.5 Contents of superoxide anions in pepper under low temperature and low light stress treated with different melatonin concentrations

由此可见，在褪黑素浓度为100 μmol·L时，SOD、CAT活性达到最高，超氧阴离子含量最低，对辣椒低温弱光胁迫的缓解作用最好。

3 讨论

低温弱光胁迫对植物的生长发育有明显的抑制作用，前人研究表明，低温弱光胁迫下辣椒的生长发育水平明显低于正常水平，其叶片中叶绿素含量明显下降，进而导致叶片失绿和光合能力下降。常静等对低温弱光胁迫下辣椒的研究发现，在低温弱光或低温处理时叶绿素含量都降低且随着胁迫处理时间的延长越明显。高青海等研究表明，低温弱光胁迫下外源200 μmol·L的褪黑素处理时，黄瓜叶片叶绿素含量比对照处理的黄瓜幼苗显著提高13.3%。与前人研究相同，本试验结果表明，叶片喷施100 μmol·L的褪黑素对低温弱光的胁迫有缓解作用，可以抑制叶绿素分解，增强低温弱光胁迫辣椒幼苗光合色素的稳定性。

叶绿素吸收的光能主要通过光化学反应、叶绿素荧光发射和热耗散3种途径来消耗。李静研究表明，在低温弱光胁迫下，辣椒幼苗会发生光抑制现象，/、(Ⅱ)会明显下降，()和()会明显增加。/也是衡量PSⅡ光抑制的重要指标，则反映植物以热形式耗散、不能用于光合电子传递的多余光能，是非辐射能量耗散诱发的荧光猝灭，(Ⅱ)的降低将会影响ATP、NADPH等同化力的形成，造成光合电子传递速率的下降，是反映PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学反应电子传递的份额，也在一定程度上反映了PSⅡ反应中心的开放程度。本研究结果表明，100 μmol·L的褪黑素处理能显著提高低温弱光下辣椒用于光合作用的能量(Ⅱ)、/、以及，降低、()和，减弱胁迫造成的光抑制程度，用于光化学反应的电子增加，以热或其他方式耗散的光能减少，与汪正香研究的外源褪黑素对低温胁迫下嫁接西瓜幼苗生长生理的影响结果一致，与唐懿等研究结果也一致，可能是喷施适宜浓度褪黑素之后能最大程度将光能用于光合作用，平衡光能分配，减轻光抑制程度，使叶片吸收的光能被用来碳固定的能量增加，但是低浓度的褪黑素对辣椒叶片光抑制现象缓解不明显，高浓度的褪黑素(>150 μmol·L)反而也会加重光抑制程度，也与之前的研究结果一致，即对于同一植物不同浓度的褪黑素可以缓解植物遭受的胁迫伤害，也可能会加速胁迫的伤害。

渗透调节作用是植物响应逆境胁迫的生理机制，许多植物的主要渗透调节物质是可溶性糖，并且对细胞膜与原生质胶体起着稳固的作用，当细胞内的无机离子浓度比较高时会起到一种保护作用。可溶性糖作为渗透调节物质，其含量增加可以提高植物的抗逆性。本试验结果表明，适宜浓度褪黑素处理促进了低温弱光胁迫下辣椒幼苗中可溶性糖积累，说明其积累是辣椒幼苗响应低温弱光胁迫的应激反应，增强辣椒幼苗的耐低温弱光性，这与赵小红等研究结果相似，即随着褪黑素浓度增加，可溶性糖呈现出先增加再降低的趋势。试验中以100 μmol·L的褪黑素浓度处理效果最好。

在逆境胁迫下植物体内将会产生大量活性氧，造成膜系统的氧化损伤。当细胞膜遭到破坏时，会引起电解质渗漏，细胞渗透性增强，本试验与赵小红等研究外源褪黑素对低温胁迫下黄瓜幼苗抗冷性的影响结果一致，即低浓度的褪黑素会保护膜系统完整，降低叶片相对电导率，高浓度褪黑素反而会增加叶片相对电导率。张嘉雯等研究表明，外源褪黑素(100 μmol·L)能显著降低低温胁迫下烟草体内超氧阴离子和MDA含量，减轻对细胞膜的伤害，这与本研究结果一致，即适宜浓度的褪黑素能降低胁迫对植物的伤害，但过高的褪黑素浓度反而会使其含量相对增加，这也与吴雪霞等在低温胁迫下茄子幼苗上的研究结果一致。可能是因为过高浓度的褪黑素反而对植物造成了一定的胁迫作用，抑制植物生长发育。褪黑素是目前已知的抗氧化作用最强的内源性自由基清除剂，它可以改善细胞的氧化还原状态，降低活性氧(ROS)水平。不仅能清除细胞内的ROS，而且能清除细胞质和细胞膜上的ROS，这与常见的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)不同。本试验结果显示，在低温弱光胁迫下，叶面喷施一定浓度的褪黑素辣椒幼苗体内SOD活性表现为先升高后降低再升高的趋势，外源施加褪黑素则使CAT活性逐渐升高，这与张嘉雯等研究外源褪黑素对低温(8 ℃)胁迫下烟草幼苗的影响不同，可能是由于作物与胁迫方式不同，因此，一定浓度范围内的褪黑素可以提高低温弱光胁迫下辣椒SOD和CAT活性。适宜浓度的褪黑素不仅可以直接作用于自由基，还可以通过提高抗氧化酶的活性来提高植物的抗逆性，这可能是褪黑素提高辣椒耐低温弱光胁迫的主要机制之一。

4 结论

综上，外源褪黑素能有效增强辣椒在低温弱光逆境下幼苗的叶绿素含量，增大植株光能捕获和转化效率，有效缓解了低温弱光条件对辣椒光合作用的破坏，并通过提高SOD和CAT活性，清除植株体内超氧阴离子，促进可溶性糖的积累，降低了MDA含量，有效缓解了低温弱光条件对辣椒的膜脂过氧化作用，保护了质膜的完整性，减少电解质的外渗，从而缓解了低温弱光胁迫对辣椒的抑制和伤害，且褪黑素浓度为100 μmol·L时效果较好。