基于可视化聚合酶交联螺旋反应快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

冯瑜菲，袁超文

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048；2.东北大学生命科学与健康学院，辽宁 沈阳 110006）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是广泛分布于自然界的一种能够引起人和动物疾病的食源性致病菌，其产生的肠毒素（Enterotoxin）等致病因子可引起呕吐、腹泻和胃肠炎等一系列疾病，甚至导致死亡[1-3]。目前由S.aureus引起的食源性感染事件已跃居于仅次于大肠杆菌和沙门氏菌感染的第3 位[4-6]。同时S.aureus也是造成奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，报道显示40%以上的牛乳腺炎病例是由S.aureus引起，给我国养殖业造成巨大威胁[7]。因此，提高基层兽医部门对该病原的检测能力，对防控该病和食品安全事件的发生具有重大意义[8]。

目前，S.aureus检测的“金标准”仍是以传统细菌分离技术为主，但因其敏感性和特异性较差，检测周期长（3 d～7 d）等缺点而存在一定局限性[9-10]。而各种商品化的酶联免疫吸附试剂盒和基于核酸检测的分子技术（如PCR）虽为S.aureus的检测提供了有效方法，但这些方法往往需要专门的实验室设备和专业的操作人员，限制了它们在基层单位的普及应用[11-12]。目前，多种等温扩增技术（Isothermal amplification techniques，IATs）已应用于医学、农业、食品等领域的病原微生物检测，IATs 因具备快速、高效且无需昂贵仪器设备的优势，可满足较大抽检数量的检测需求[13-14]。聚合酶交联螺旋反应（Polymerase crosslinking spiral reaction，PCLSR）是近年来报道的一种新型等温扩增技术，该技术的原理与环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术类似，能够利用具有链置换活性的Bst 聚合酶在恒温条件下对目的基因大量扩增，PCLSR 法因引物设计更为简便，且具有特异性强和敏感性高等优势，使得该方法在非洲猪瘟病毒和犬细小病毒检测方面取得了良好应用效果[15-16]。

因此，本研究以S.aureus的耐热核酸酶基因（nuc）作为靶基因设计PCLSR 特异性引物，同时结合特殊封闭的反应管和SYBR Green I 染料来判断反应结果，通过与现有的荧光定量PCR 和LAMP 等比较，为基层兽医部门快速检测S.aureus提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌种来源本研究共涉及的23 株细菌（包括4 株S.aureus参考株、9株非S.aureus参考株、10株S.aureus临床分离株）如表1所示，分别购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中国医学细菌菌种保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collection，CMCC）及中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC），其中临床分离株（Isolates）为本研究室保存。

表1 实验用菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 检测样品与主要试剂巴氏灭菌纯牛奶、生猪肉样品购自当地市场，且经鉴定均不含S.aureus。营养琼脂培养基购自北京陆桥技术有限公司；Bst-DNA聚合酶大片段购自NEB（北京）公司；脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、MgSO4、基因组提取试剂盒、DNA 标准分子量Marker，均购自北京赛百盛生物有限公司；甜菜碱购自Sigma 公司；SYBR Green I 染料购自宝生物工程（大连）有限公司；华峰管购自广州华峰生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成本研究以S.aureus nuc（DQ399 678.1）保守序列为靶基因，利用Primer-Explorer V5 software 设计PCLSR 特异性引物。上下游引物为Ft-5'-gtcaaagcgatcccgccttac-AGATAACGGCGTAAATAG-3'/Bt-5'-cattccgccctagcgaaactg-ATACCAGGACTTCGTT CA-3'，交联引物（cross-linking primer）：5'-GAAGA TCCAACAGTATATAGTGCTTTAAACGTAGGATTTTTTC CACATCTC-3'，斜体为保护性碱基，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 人工污染样品的制备及DNA 的提取将标准菌S.aureusATCC 25923 过夜振荡培养后细菌计数，将新鲜菌液10 倍倍比稀释后参照文献[17]方法制备灭菌纯牛奶和生猪肉样品的人工模拟污染源。别外利用DNA 纯化试剂盒分别提取表1 中细菌的基因组DNA，-20 ℃下保存，用于后续PCLSR 法、LAMP 法和qPCR 法的扩增模板。

1.5 PCLSR 体系的建立与优化为保证建立的PCLSR 法能达到最佳的可视化检测效果，在反应开始前向华峰管一侧滴加1 μL（2 000×）SYBR Green I 荧光染料，并在管的另一侧配制反应体系（30 μL），具体如下：10×Bst polymerase buffer 3 μL、2.0 mmol/L dNTPs 3 μL、4 μmol/L MgSO42 μL、10 μmol/L 上游/下游引物（Ft/Bt）各2 μL、10 μmol/L 交联引物（crosslinking primer）3 μL、1.0 mol/L 甜 菜 碱 溶 液2 μL、Bst-DNA 聚合酶大片段8 U（1.0 μL）、DNA 模板2 μL、灭菌去离子水10 μL。以上体系在60 ℃金属浴中反应60 min，然后在85 ℃孵育5 min 以终止反应。反应完成后将预先添加的SYBR Green I 染料与扩增产物缓慢混匀以判定扩增结果，随后扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

为降低PCLSA法检测成本并提高检测效率，分别对反应温度（60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃、70 ℃）、dNTPs 浓度（1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L）、Bst-DNA聚合酶大片段浓度（6 U/管、8 U/管、10 U/管、12U/管）及孵育时间（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min）采用方阵法优化，每个反应均重复3次，反应结束后经2%琼脂糖凝胶电泳检测并分析，以确定最佳反应条件。

1.6 PCLSR 的特异性试验以DNA 提取试剂盒提取的4 株S.aureus参考株、10 株S.aureus临床分离株）和9 株非金黄色葡萄球菌的DNA 作为模板，进行PCLSR法的特异性试验，设灭菌去离子水为阴性对照。

1.7 PCLSR 的敏感性试验本研究对过夜培养的S.aureusATCC 25923 标准菌进行平板计数后将初始菌液浓度调整为1×107cfu/mL，10 倍倍比稀释（1×107cfu/mL～1×100cfu/mL）后分别提取DNA 作为模板，进行PCLSR 扩增。同时，以上述菌液DNA 作为模板，分别利用文献[18,19]中的LAMP 和荧光定量PCR扩增，比较三者的敏感性。

1.8 PCLSR 法对人工污染样品的检测为进一步明确PCLSR 法在模拟临床样品中的检测能力，本研究使用1.4 中S.aureusATCC 25923 菌株随机污染的灭菌纯牛奶26 份、生猪肉样品20 份，以GB 4789.10-2016《食品微生物学检验-金黄色葡萄球菌检验》中分离培养法[20]的检测结果作为参照标准，利用基因提取试剂盒提取以上样品DNA 分别进行PCLSR 法、LAMP 法和荧光定量PCR 法检测，并比较4 种方法与传统培养法的检测符合率。

2 结 果

2.1 检测方法的建立与优化本研究以S.aureus的耐热核酸酶基因（nuc基因）为靶基因初步建立PCLSR，结果显示，自然光下观察阳性扩增结果呈绿色，而阴性结果为橙色（图1A），紫外光下观察阳性扩增结果为绿色荧光，而阴性扩增无显著变化（图1B）。2%琼脂糖凝胶电泳显示，PCLSR法的阳性扩增产物呈典型的梯状条带，而阴性扩增无条带（图1C）。

图1 PCLSR的扩增结果Fig.1 Amplication results of the PCLSR

进一步优化反应条件结果显示，该PCLSR 反应的最佳扩增条件为62 ℃、60 min、3.0 mmol/L dNTPs和10 U/管Bst-DNA 聚合酶大片段（图2）。

图2 PCLSR反应条件的优化结果Fig.2 Optimization of PCLSR system

2.2 特异性试验结果以1.4 中提取的各细菌基因组DNA为模板评价PCLSR法的特异性，结果显示，所有S.aureus菌株扩增产物在紫外光下呈现绿色荧光，在琼脂糖凝胶中呈典型梯状条带，而在非S.aureus菌株的扩增引物中未观察到显著变化，且在琼脂糖凝胶中未见任何条带（图3）。以上结果表明，所建立的PCLSR 法的特异性较强。

图3 PCLSR的特异性试验结果Fig.3 Specificity test of the PCLSR assay

2.3 敏感性试验结果提取10倍倍比稀释的S.aureus菌株基因组DNA作为模板，分别采用PCLSR、荧光定量PCR 和LAMP 检测。结果显示，PCLSR 法与荧光定量PCR 法具有相同的敏感性，均为1×102cfu/mL，而LAMP 法敏感性为1×103cfu/mL（图4），表明本研究建立的PCLSR 法的敏感性较高。

图4 PCLSR法的敏感性试验结果Fig.4 Analytical sensitivity of the PCLSR assay

2.4 人工污染样品检测结果本研究使用46 份经S.aureus人工污染的食品样品（灭菌纯牛奶26 份，生猪肉样品20 份）模拟临床样品。采用传统细菌培养法、PCLSR 法、LAMP 法和qPCR 法检测，结果显示，PCLSR 法与荧光定量PCR 法共检出S.aureus12 株，二者的符合率均为100%；而细菌培养法和LAMP 法共检出11 株S.aureus，与PCLSR 的符合率均为91.67%。PCLSR 法的检出数量与初始人工模拟污染数量（12/46）相一致，但却高于LAMP 法和传统细菌培养法的检测结果（表2）。表明PCLSR 更准确，能够满足临床S.aureus检测需求。

表2 人工污染样品的检测结果Table 2 The detection results of artificially contaminated samples

3 讨 论

本研究基于S.aureus的nuc基因保守序列设计引物，并经各反应条件的优化建立了特异性强、敏感性高的可视化PCLSR 检测方法，与众多等温扩增技术相似，该方法同样能够利用Bsm、Bst 或GspSSD DNA 聚合酶在恒温条件下完成对目标基因的大量扩增。本研究结果显示，设计的PCLSR 特异性引物能够在62 ℃、60 min、3.0 mmol/L dNTPs 和10 U/管Bst-DNA 聚合酶大片段条件下达到最佳扩增效果，且PCLSR 法的整个检测过程可以在90 min 内完成。

截至目前，等温扩增技术的反应结果判定主要基于以下两种策略：一是利用横向流动试纸条（Lateral flow strips，LFB）对扩增产物进行免疫印迹分析，另一种则是向反应体系内添加能与双链DNA 结合的荧光染料以观察颜色变化。前者因制备工艺复杂，成本昂贵，限制了其大规模应用，后者因不能克服气溶胶造成的污染，常导致假阳性结果[21-22]。为此，本研究选择特殊的闭合反应管对PCLSR 法进行可视化检测，反应前将荧光染料和反应试剂置于反应管两侧，反应后将荧光染料与反应产物混匀即可直接读取结果，可有效地防止因打开反应管而造成的气溶胶污染。本研究建立的PCLSR 法具有较强特异性，能够准确识别所有S.aureus菌株，并在琼脂糖凝胶电泳上形成典型的梯形条带，且与SGI 染料混合时在紫外光下可观察到绿色荧光。而对于非S.aureus菌株，琼脂糖凝胶电泳中未出现特异性条带且紫外线下也未观察到变化，该结果与LAMP 结果一致。在敏感性分析方面，该PCLSR 法与qPCR 方法的敏感性相同，为1×102cfu/mL，但比LAMP 法的敏感性高10 倍。此外，本研究使用人工随机污染食品样品对PCLSR 法的应用效果进行了评价， PCLSR 法和qPCR 法对人工污染食品样品阳性检出率相同，且二者的符合率均为100%，表明PCLSR 法作为一种新型的等温扩增技术可以用于临床检测。

综上所述，本研究基于S.aureus的nuc基因建立的PCLSR 检测法，不仅具有快速、特异性强、敏感性高及低成本等特点，且不需复杂昂贵的仪器设备和苛刻的实验室条件，为基层兽医诊断和食品卫生检验等领域提供一种新的检测手段。