河南地区家兔呼吸系统感染病原菌的分离鉴定及耐药性分析

张自强，王佳佳，谢 辉，张 昕，徐靖怡，常赵阳，刘 宁，刘玉梅

（河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471000）

兔呼吸道感染是兔的一种常见疾病，具有多发性和反复发作的特点[1-2]。自2020 年7 月1 日全面禁止在饲料中添加抗生素以来，各地家兔呼吸系统疾病的发病率和死亡率呈不同程度的上升，对家兔健康养殖造成了严重危害，因此临床及时采取有效手段治疗该病尤为重要。引起家兔呼吸系统疾病的原因较为复杂，常因地域、气温、食物及饲养管理水平的差异而造成家兔不同类型的呼吸系统疾病，其中细菌性感染最为严重[3]。家兔呼吸系统感染的病原菌主要包括肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）、支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）、绿脓假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereous，B.cereous）等，其中以Kpn、Bb、Pm 和S.aureus的感染率较高。随着广谱抗菌药物的滥用，抗菌药所致病原菌的耐药情况日益严重，给疫病防控带来了极大困扰。本研究通过对河南地区部分规模化兔场家兔呼吸道病原菌的分离鉴定及耐药性分析，可为及时掌握本地区病原菌的种类及耐药性，指导临床用药，减少耐药菌株的产生提供科学支持。

1 材料与方法

1.1 菌株来源2019 年9 月～2021 年9 月来自河南地区36 个规模化兔场的呼吸系统感染病例143 例，其中豫东地区28 例、豫西地区26 例、豫中地区23例、豫南地区20 例、豫北地区46 例。无菌采集病兔肺脏、气管等组织，进行病原菌的分离培养及检测，并且去除同一病兔分离出的重复菌株。

1.2 主要试剂药敏纸片、LB 固体培养基和血清琼脂培养基（含5%新生胎牛血清）购自北京索莱宝科技有限公司；PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0 plus dye）购自TaKaRa 公司；Proteinase K、细菌基因组DNA 小量提取试剂盒、DL2000 DNA Maker 购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；溴化乙锭溶液购自苏州天可贸易有限公司。

1.3 病原菌的分离、PCR鉴定及结果的统计 无菌采集病兔肺脏、气管等组织，分别接种于LB 固体培养基和血清琼脂培养基（含5%新生胎牛血清），37 ℃培养24 h～36 h 后，观察菌落的生长情况。挑取疑似菌落经革兰染色，镜检。采用平板划线法纯化分离菌种，取纯化后的菌液，提取细菌DNA 后作为模板，根据以往研究结果，以表1 中的引物进行7 种致兔呼吸系统感染的主要病原菌的PCR 扩增[4]。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。根据检测结果采用Excel 2016 分析分离菌的种类及其在不同地区的感染率等。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 分离菌的药敏试验采用K-B 纸片扩散法检测分离菌对10 类22 种药物的敏感性，依据美国临床检验标准委员会（NCCLS）2016 年版判定结果[11]。

2 结 果

2.1 病原菌的分离鉴定及统计分析结果将河南地区36 个规模化兔场的143 例呼吸系统感染病例的肺脏、气管等组织接种LB 固体培养基和血清琼脂培养基，进行病原菌的分离。结果显示，共检出262 株病原菌。经革兰染色镜检后共检出G+菌103 株（39.31%），G-菌159 株（60.69%）。PCR 鉴定结果显示分离的G+菌以S.aureus、S.pneumoniae、B.cereus等为主，其感染率分别为50.35%（72 株）、10.49%（15株）、5.59%（8株）；G-菌以Kpn、Bb、Pm、P.aeruginosa等为主，其感染率分别为41.96%（60 株）、36%（52 株）、19.58%（28 株）、8.39%（12 株）（表2）。表明G+菌中的S.aureus以及G-菌中Kpn、Bb 和Pm 是造成兔呼吸系统感染的主要致病菌，同时也与P.aeruginosa、S.pneumoniae等病原菌密切相关。其中两种及多种病原菌混合感染病兔的感染率高达76.22%（109/143）。在病原菌的二重感染病例中，混合感染率最高的组合是S.aureus和Kpn，共23 例（16.08%）。在病原菌的三重感染病例中，混合感染率最高的组 合 是S.aureus、P.aeruginosa和Kpn 以 及S.aureus、P.aeruginosa和Bb，均为6 例（4.2%）（表3）。表明兔呼吸系统多为混合感染，且多为兔S.aureus常与其他病原菌的混合感染，致感染率较高。

表2 家兔呼吸系统主要病原菌的分离鉴定及统计分析Table 2 Distribution and composition of main pathogenic isolates in rabbit respiratory system

表3 病原菌混合感染率的统计Table 3 Statistics of mixed infection rate of pathogenic bacteria mode

不同地区致家兔呼吸系统疾病感染病原菌的统计分析结果显示，豫东地区28 例病兔共分离到44 株菌，其中主要为S.aureus13 株（29.55%）、Bb 11株（25.00%）、Kpn 8 株（18.18%）、P.aeruginosa4 株（9.09%）、S.pneumoniae3 株（6.82%）、B.cereus3 株（6.82%）、Pm 2 株（4.55%）。豫西地区26 例病兔共分离到42 株菌，其中主要为Bb 12 株（28.57%）、S.aureus10 株（23.81%）、Kpn 8 株（19.05%）、Pm 4 株（9.52%）、B.cereus4 株（9.52%）、P.aeruginosa2 株（4.76%）、S.pneumoniae2 株（4.76%）。豫中地区23 例病兔共分离到42 株菌，其中主要为Kpn 16 株（38.10%）、Bb 11 株（26.19%）、S.aureus5 株（11.90%）、S.pneumoniae5株（11.90%）、P.aeruginosa3株（7.14%）、Pm 1 株（2.38%）、B.cereus1 株（2.38%）。豫南20 例病兔共分离到39 株菌，其中主要为S.aureus19株（48.72%）、Bb 10 株（25.64%）、Kpn 4 株（10.26%）、B.cereus3 株（7.69%）、S.pneumoniae2 株（5.13%）、Pm 1 株（2.56%）。豫北地区46 例病兔共分离到80 株菌，其中主要为S.aureus25 株（31.25%）、Kpn 24 株（30.00%）、Pm 22 株（25.00%）、Bb 8 株（10.00%）、S.pneumoniae3 株（3.75%）（表4）。表明，不同地区分离的致兔呼吸系统疾病的主要病原菌有明显差异。

表4 不同地区家兔呼吸系统主要病原菌的统计分析Table 4 Statistical analysis of main pathogenic bacteria of rabbit respiratory system in different areas of Henan province

2.2 分离的主要G+菌的药敏试验结果药敏试验结果显示，分离的主要G+菌中的S.aureus耐丁胺卡那、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢唑林、氟苯尼考、多粘菌素B 的菌株占比＜50%，对其余抗菌药物耐药的菌株≥50%（未检测的除外），对多肽类的杆菌肽耐药性高达80%及以上；分离的S.pneumoniae中耐恩诺沙星、复方新诺明、杆菌肽的菌株＞50%，对其余抗菌素耐药的菌株均＜50%（未检测的除外），其中对头孢菌素类的头孢哌酮均敏感（表5）。表明，分离的致兔呼吸道疾病的G+菌耐药较严重。

表5 分离的主要G+菌耐药情况的统计Table 5 Statistical analysis of drug resistance rate of the isolated main G+bacteria

2.3 分离的主要G-菌的药敏试验结果药敏试验结果显示，分离的Kpn 中耐哌拉西林、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢唑林、呋喃唑酮、多粘菌素B 的菌株占比均＜50%，对其余抗菌药物耐药的菌株＞50%（未检测的除外），其中对恩诺沙星、复方新诺明、氨苄西林、杆菌肽耐药的菌株达100%；分离的Bb中耐红霉素、麦迪霉素、恩诺沙星、复方新诺明、氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、呋喃唑酮、杆菌肽的菌株均＞50%，对其余抗菌药物耐药的菌株＜50%（未检测的除外），其中对哌拉西林、头孢哌酮均敏感；分离的Pm 中耐庆大霉素、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢唑林、氟苯尼考、呋喃唑酮、多粘菌素B、多西环素、四环素的菌株均＜50%，对其余抗菌药物耐药的菌株均≥50%（未检测的除外），其中对麦迪霉素、复方新诺明、杆菌肽耐药的菌株达100%；分离的P.aeruginosa中耐阿奇霉素、诺氟沙星、环丙沙星、头孢哌酮、头孢唑林、氟苯尼考、多粘菌素B 的菌株均＜50%，对其余抗菌药物耐药的菌株均＞50%，其中对红霉素、氨苄西林、呋喃唑酮、杆菌肽耐药的菌株达100%（表6）。表明，分离的致兔呼吸道疾病的G-菌耐药情况较复杂，且耐药较严重。

表6 分离的主要G-菌耐药情况的统计Table 6 Statistical analysis of drug resistance rate of the isolated main G-bacteria

续表

3 讨 论

目前，我国养兔业发展迅速，规模化兔场快速增加。相关研究报道，家兔疾病中呼吸道疾病占据第二，占家兔总疾病的20%以上[12]。呼吸道疾病是规模化兔场的常见病，病因多为细菌性感染。当家兔生活环境变化，如气温突然升降、饲料更换、饲养场所变动以及长时间处于应激状态时，家兔自身免疫系统功能下降，对致病菌的抵御能力降低，极易引起以鼻炎、肺炎等为主要症状的呼吸系统疾病，严重危害家兔的健康养殖[13-15]。因此，及时对兔呼吸系统病例的病原菌进行检测分析、确定病原菌的耐药状况，对家兔疾病防治及临床制定合理有效的治疗方案尤为重要。

本研究的143 只呼吸系统患病兔主要来源于河南地区36 个规模化兔场，共分离出262 株病原菌，其中G-菌159 株，占60.69%，其次是G+菌103 株，占39.31%，另外还分离出少部分真菌。此外，本研究还发现兔发生呼吸系统疾病主要集中在温度变化较大的秋冬季节以及初春时节，且各个地区均有发生。表明致兔呼吸系统感染的病原菌以G-菌为主，分析原因可能与兔舍秋冬及初春日夜温差较大，养殖密度大，通风不当换气不足，患病兔自身免疫系统功能低下，对致病菌抵御能力较差有关[16-17]。本研究结果显示，分离的G-菌中Kpn、Bb 和Pm 以及G+菌中的S.aureus是河南地区家兔呼吸系统感染的最主要致病菌，同时其呼吸系统感染也与P.aeruginosa、S.pneumoniae等病原菌密切相关。通过对河南不同地区兔呼吸系统感染病原菌的进一步分析，结果显示在不同地区分离的主要病原菌有差异。豫东、豫南和豫北地区检出率最高的均为S.aureus，而豫西和豫中地区检出率最高的分别为Bb 和Kpn。豫东、豫西、豫中、豫南地区检出率前3 的均为S.aureus、Bb和Kpn，但豫北地区除了S.aureus和Kpn 外，检出率前3 的还有Pm。除了饲养环境、饲养管理不同之外，可能也与家兔的品种和饲养周期有关，与其他地区饲养育肥兔不同，豫北地区检测的样品多为饲养周期较长的长毛兔。由于长毛兔比其他兔饲养周期长，呼吸道疾病为其常见病、多发病，且多数以慢性感染为主，发病率较高，但死亡率低，易被养殖户忽视，本研究的统计结果也显示豫北地区致兔呼吸道疾病病原菌较其他地区多。

现阶段主要以抗生素治疗兔的呼吸系统感染，但随着广谱抗菌药物的广泛应用，病原菌对抗菌药物的耐药性明显增加，为临床呼吸系统感染治疗增加了难度[18]。相关研究表明，G+菌对大环内酯类、磺胺类及四环素类抗菌药物耐药比较强，耐药菌株高达56.10%～97.56%[19]。本研究结果显示，G+菌中S.aureus对头孢菌素类（头孢哌酮、头孢氨苄、头孢唑林）、酰胺醇类（氟苯尼考）及多肽类中的粘菌素B耐药比较低，耐药菌株在0～38.10%；而对其他氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、四环素类及多肽类的杆菌肽耐药比较强，耐药菌株高达47.83%～100.00%。结果与相关研究报道基本一致[19]，表明头孢菌素类、酰胺醇类以及部分多肽类抗菌药物对G+菌的抗菌活性最强，头孢、氟苯尼考以及多粘菌素B 可作为G+菌感染治疗的首选药物，而其他氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺类、四环素类及多肽类药物则需要根据药敏结果选择用药。

大量研究表明，G-菌（Kpn、Bb、Pm）对喹诺酮类、β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类药物的耐药性比较强[20-22]。而本研究结果显示，G-菌中Kpn、Bb和Pm 对多肽类的多粘菌素B的耐药性最低，耐药菌株在6.67%～25.00%，而对同样为多肽类的杆菌肽耐药的菌株高达100.00%，同时对大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药性比较强。多粘菌B 可作为G-菌感染治疗的首选，而其他氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、β-内酰胺类、头孢菌素类、酰胺醇类、多肽类、四环素类药物则应根据药敏结果选择用药。

本研究结果还显示，两种及多种病原菌混合感染兔的感染率高达76.22%，混合感染十分严重，分析原因可能是家兔被致病菌感染后会造成其机体免疫力下降，环境中广泛分布的病原菌和家兔体内存在的条件性致病菌很易感染家兔，导致继发性感染，所以及时准确检测病原和快速有效用药控制疾病非常重要，根据药敏试验结果，选择高敏药物，并配合环境消毒、通风干燥，对控制疫病的蔓延有重要意义。

本研究通过对河南地区规模化兔场致兔呼吸道疾病病原菌的检测和耐药性分析，及时掌握了不同呼吸道疾病的发病状况和菌株耐药情况，为河南地区兔养殖业呼吸道疾病的诊治和用药提供了参考。