子宫内膜异位症不孕患者着床窗口期内膜组织中MDM4、miR-144-3p表达及其意义

苗红艳 王飞刚 韦彩霞 宋瑞香

河南省三门峡市中心医院(472000)

子宫内膜异位症(EMS)与不孕关系密切，有25%～47%的EMS患者出现不孕症状，且不孕患者中较多患者发生EMS[1]。需寻找密切相关的生物指标，用于疾病的治疗和预后评估。鼠双微体4(MDM4)又称MDMX，是p53的重要调控因子。有研究显示，恶性肿瘤中MDM4对p53的表达有抑制作用[2]；张丽莉等[3]研究显示，MDM4与绒毛外细胞滋养层细胞的迁移和侵袭有关。而既往研究显示，绒毛外细胞滋养层细胞侵袭能力不足与不孕存在一定关系[4]。前期研究中微小RNA-144-3p(miR-144-3p)与MDM4可能存在靶向调节关系。因此，本研究探究EMS不孕及输卵管因素不孕患者子宫内膜组织中miR-144-3p、MDM4表达水平及意义。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集本院2019年10月—2021年8月资料齐全的EMS不孕患者62例为EMS组，输卵管因素不孕患者59例为对照组。EMS诊断主要符合《子宫内膜异位症的诊断与治疗规范》[7]依据有痛经、慢性盆腔痛、性交痛等疼痛且不孕；B超检查影像为附件区无回声包块，内有强光点；妇科检查子宫为后位、活动度差，宫骶韧带、子宫直肠陷凹或后穹隆触痛结节，可同时存在附件囊性、不活动包块；血清CA125水平轻中度升高。输卵管因素不孕诊断：宫腹腔镜观察宫腔、输卵管开口情况及两侧输卵管行通液、输卵管通畅度，输卵管扭曲36例、输卵管积液阻塞16例、伞端闭锁7例；EMS患者卵巢储备功能正常，月经规律，无不规则阴道流血；③性生活正常，未避孕而不孕1年以上。排除有EMS手术病史，合并脏器功能异常及恶性肿瘤，6个月内有妊娠史、哺乳史及刮宫手术史。研究获本院临床伦理委员会批准且患者签署知情同意书。

1.2 样品采集

研究对象自月经周期第9天起采用B超监测卵泡生长状况，当卵泡直径达14 mm时行宫腔镜检查并行子宫内膜活检，获得卵泡期子宫内膜组织。继续监测，每天尿LH试纸检测2次，当LH试纸出现双线，同时B超检查见排卵征象后的5 d行子宫内膜活检，获得着床窗口期子宫内膜组织。将获得的子宫内膜组织部分置于液氮中冻存，用于mRNA检测；部分置于10%的甲醛溶液中固定，用于MDM4蛋白检测。

1.3 子宫内膜组织MDM4mRNA、miR-144-3p表达水平检测

采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测组织MDM4 mRNA、miR-144-3p表达水平。RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取子宫内膜组织总RNA，Nano Drop2000微量分光光度计(美国Thermo公司)检测RNA浓度。取RNA，使用反转录试剂盒(北京凯诗源生物科技有限公司)反转录为cDNA。采用ABI 7500型RT-qPCR仪(美国ABI公司)扩增，扩增条件：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算子宫内膜组织MDM4 mRNA、miR-144-3p相对表达量，U6、GAPDH分别为miR-144-3p、MDM4的内参基因，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 MDM4蛋白检测

采用免疫组织化学法[试剂盒购自西宝生物科技(上海)股份有限公司]检测子宫内膜组织MDM4蛋白表达水平。阳性率评分：阳性细胞>75%记4分，51%～75%记3分，26%～50%记2分，5%～25%记1分，<5%记0分；染色强度评分：棕褐色记3分，棕黄色记2分，淡黄色记1分，无着色记0分。以阳性率评分和染色强度评分乘积为免疫组织化学染色最终评分，0～2分为阴性，>2分为阳性。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料

两组一般临床资料比较无差异(P>0.05)。见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 着床窗口期子宫内膜组织中MDM4、miR-144-3p水平

EMS组着床窗口期子宫内膜组织中MDM4 mRNA水平及蛋白阳性率高于对照组，miR-144-3p水平低于对照组(P<0.05)。见表3、图1(1212页)。Pearson法分析，EMS组着床窗口期子宫内膜组织中MDM4 mRNA与miR-144-3p水平呈负相关(r=-0.679，P<0.05)；Spearman法分析，MDM4蛋白与miR-144-3p水平呈负相关(r=-0.502，P<0.05)。

2.3 卵泡期子宫内膜组织中MDM4、miR-144-3p水平

卵泡期子宫内膜组织中miR-144-3p、MDM4 mRNA水平及蛋白阳性率两组无差异(P>0.05)。见表3。Pearson法分析，EMS组卵泡期子宫内膜组织中MDM4 mRNA与miR-144-3p水平呈负相关(r=-0.359，P<0.05)；Spearman法分析，MDM4蛋白与miR-144-3p水平呈负相关(r=-0.432，P<0.05)。

表3 两组不同期子宫内膜组织中各指标比较

3 讨论

EMS患者以盆腔疼痛、月经失调、不孕等症状为主要临床表现，EMS是引起女性不孕的重要原因之一[5]。本研究结果显示，EMS不孕患者与输卵管因素不孕患者痛经症状差异不显著，可能是由于纳入样本量较小及纳入病例的偏倚性，本研究纳入的EMS不孕患者病情相对较轻，今后将加大样本量进一步探究。目前关于EMS不孕的发生机制仍未完全阐明，随着研究深入，越来越多证据表明，EMS患者在位子宫内膜容受性下降所致的着床失败是不孕的重要原因[6]。

MDM4作为一个原癌基因在多种肿瘤中高表达，且能调控p53等蛋白表达[7-8]。张惟等[9]研究显示，MDM4与肾癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力密切相关；Palomares等[10]研究显示，MDM4及p53基因多态性与持续妊娠及可变流产事件相关。miRNA的异常表达可影响细胞增殖、分裂、凋亡、发育，参与恶性肿瘤形成、发展及转移、侵袭等过程，且与EMS及不孕密切相关[11]。miR-144-3p也广泛参与各类细胞的增殖等过程[12-13]。钱进等[14]研究表明，miR-144可通过调控MDM4的表达来抑制成纤维样滑膜细胞在炎症环境中的增殖。

本研究结果显示，EMS不孕患者着床窗口期、卵泡期子宫内膜组织中MDM4 mRNA、MDM4蛋白与miR-144-3p水平均呈负相关，与既往文献中MDM4与miR-144-3p的表达趋势及调控关系一致，且在EMS不孕患者中进一步验证了生物信息学分析结果中MDM4与miR-144-3p的靶向关系。此外，本研究结果显示，EMS不孕患者着床窗口期子宫内膜组织中MDM4表达高于输卵管因素不孕患者，miR-144-3p低于输卵管因素不孕患者，而在卵泡期中其表达未见差异。有研究显示，胚泡着床是一个复杂的生理过程，其着床前及着床过程中，子宫内膜及胚泡均处于动态发育过程，而胚泡着床必须子宫内膜与胚泡处于同步发育且相互配合才能完成[15]。而仅在窗口期时子宫内膜才允许胚泡着床，此时期子宫内膜对胚泡的接受能力即子宫内膜容受性[16]。基于既往文献推测，EMS患者体内病理因素造成着床窗口期miR-144-3p表达水平下降，而miR-144-3p靶向调节MDM4，使其蛋白表达增加，MDM4异常表达改变了p53的基因的功能[17]。进一步介导免疫炎症反应，产生各类细胞因子，影响胚泡着床，导致子宫内膜容受性降低，最终影响不孕的发生发展，但其具体生物机制有待进一步通过动物模型和细胞模型验证。

综上所述，EMS不孕患者着床窗口期子宫内膜组织中MDM4高表达，miR-144-3p低表达，二者呈负相关。然而本研究中关于MDM4、miR-144-3p与EMS不孕的关系研究仍处于初步阶段，仅探索了二者在EMS不孕患者及输卵管因素不孕患者中的表达情况。随着今后对EMS不孕患者中MDM4、miR-144-3p异常表达的深入研究，有望能进一步阐明EMS不孕的发病机制，了解其生物学机制，进而为治疗EMS及其不孕症提供新方法。