植物乳杆菌DY6的生理特性及代谢机制分析

刘颖颖，卢艳波，杨小雁，马忠玛，毛银，周胜虎，邓禹*

1(江南大学，粮食发酵工艺及技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122)2(山东省油脂油料精深加工技术重点实验室，山东渤海实业集团有限公司，山东 滨州，256500)

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)广泛存在于动物、植物、人类体表和体内，以及众多发酵食品等自然和人工环境中。植物乳杆菌具有较强的糖代谢和产酸能力，拥有大量的碳水化合物水解酶和糖基转移酶等酶系[1]，因此可以利用糖类等碳源产生大量乳酸、乙酸和双乙酰等，这些代谢产物对病原体和致病菌具有显著的抑制作用[2]。此外，植物乳杆菌利用氨基酸可以合成众多的风味化合物，主要依赖于氨基酸分解代谢途径中氨基转移酶和脱羧酶。植物乳杆菌因其丰富的益生代谢产物和酶系而常被广泛应用于食品发酵、动物饲料、工业生产和医疗保健等领域。

自2001年第1株乳酸菌(Lactococcuslactissubsp.lactisIL1403)全基因组测序完成，乳酸菌基因组测序便进入了新时代[3]。多种植物乳杆菌全基因组信息得到破译并进行了功能基因解析[1]。ZHANG等[4]使用全基因组学和蛋白质组学等技术，从植物乳杆菌P-8中筛选出大量与葡萄糖代谢相关的差异表达蛋白，并预测了其特异性功能。结果表明菌株主要通过减少葡萄糖消耗和增加葡萄糖生成，从而积累或消耗氨基酸、改变细胞膜等多种生存机制来应对葡萄糖饥饿反应。目前全球范围内被广泛用于研究的鼠李糖乳杆菌LGG、嗜酸乳杆菌NCFM和干酪乳杆菌代田株等都经过了多种益生特性和基因组的研究[5-6]。然而，国内目前对于植物乳杆菌资源的综合开发和利用大多还集中在发酵菌株的筛选及菌株自身发酵工艺优化等领域，对于发酵菌种的功能特性与优异模式菌株的关联研究还远远不足。因此，通过与模式菌株的基因序列比对和基因组结构分析，更深入地了解植物乳杆菌生理特性和表型具有重要意义。

目前，植物乳杆菌WCFS1是测序较早、遗传信息较全面的乳杆菌菌株，具有代谢多样性，生长速度快，糖摄取率高等特点，常被作为模式菌株进行研究[7-8]。本团队前期筛选获得了1株植物乳杆菌DY6，具有生长速率快、产酸能力强、代谢产物丰富等特点，具有成为乳杆菌模式菌株的潜质，但是缺少遗传信息。因此，本研究首先对比了植物乳杆菌WCFS1和DY6的生理特性和益生功能，随后通过基因组重测序和比较基因组技术，系统分析了植物乳杆菌WCFS1和DY6的遗传差异，挖掘重要性状相关的功能基因，对以植物乳杆菌DY6为模式菌株的系统生物学以及代谢工程研究和应用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

植物乳杆菌DY6为实验室保藏，植物乳杆菌WCFS1购自北京北纳创联生物技术研究院，大肠杆菌(ATCC25922)和沙门氏菌(ATCC14028)均购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

MRS培养基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氢二钾2，柠檬酸三铵2，醋酸钠5，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温80 1 mL，pH 6.3～6.5。发酵培养基(g/L)：碳源(分别选用蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖)20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氢二钾2，柠檬酸三铵2，醋酸钠5，七水硫酸镁 0.58，四水硫酸锰0.25，吐温80 1 mL，pH 6.3～6.5。所有培养基均经过115 ℃、30 min灭菌后使用，其中固体培养基需额外添加2%(质量分数)的琼脂粉后进行灭菌。

1.1.3 仪器和试剂

UV-1800分光光度计，日本Shimadzu公司；CFX96实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；1260Ⅱ高效液相色谱，美国安捷伦公司；Master-S15实验室纯水系统，上海和泰仪器有限公司等。

葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、醋酸钠、吐温80、二甲苯、乙酸乙酯、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、氯化钠、三氯乙酸、三乙胺、甲醇、乙腈、胃蛋白酶、猪胆盐、胰蛋白酶等，国药化学试剂有限公司。

1.2 乳酸菌生理学特性测定

1.2.1 菌株培养和菌悬液制备

挑取单菌落接种在MRS液体培养基中，在37 ℃、250 r/min条件下培养12～16 h，获得种子液。将种子液按照2%的接种量转接到装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶中，在37 ℃、250 r/min条件下培养48 h。取上述24 h发酵液，在4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次后重悬，调至OD600值为0.8～0.9，获得菌悬液。本研究所有检测均进行了3次重复试验，误差线代表3次实验的方差。

1.2.2 代谢产物检测

发酵液在12 000 r/min离心10 min后取上清液与10%的三氯乙酸等体积稀释，放置1 h后经双层滤纸过滤，滤液在15 000 r/min离心30 min后采用Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱测定代谢产物。检测乳酸和乙酸等有机酸时色谱柱为BIO-RAD Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm，0.6 mL/min的5 mmol/L H2SO4洗脱，柱温为35 ℃，采用示差检测器。检测氨基酸时采用Agilent Hypersil ODS柱40 ℃梯度洗脱，流动相A为27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比为500∶0.11∶2.5)，流动相B为80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(体积比为1∶2∶2)，流动相pH为7.2。洗脱程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24 min，0% B；紫外检测器检测波长为338 nm，脯氨酸以262 nm检测；氨基酸含量以1 nmol/μL的21种氨基酸标准品定量。

1.2.3 生理特性测定

植物乳杆菌的酸和胆盐的耐受性测定参考王祎然等[9]的方法。将活化后的菌液按2%接种量分别接种于pH为2.0、2.5和3.0的MRS液体培养基中，对照组是pH为6.0的MRS培养基，37 ℃静置培养4 h，取0 h和4 h样进行平板菌落计数，计算不同酸性条件下的存活率(公式1)。将活化后的菌液按2%接种量分别接种于含0.1%、0.2%、0.4%、0.6%(质量分数)猪胆盐的MRS液体培养基中，以不加猪胆盐的MRS培养基为对照，37 ℃培养4 h，取0 h和4 h样品进行平板菌落计数，计算不同猪胆盐含量条件下的存活率(同公式1)。取1 mol/L 盐酸溶液20 mL，用氢氧化钠溶液将其pH调至3，加入胃蛋白酶使其终质量浓度为1 g/100mL，0.22 μm微孔滤膜除菌制备模拟胃液[10]。500 mL水溶解6.8 g磷酸二氢钾，用氢氧化钠溶液调pH至6.8，加入10 g胰蛋白酶后定容至1 000 mL，0.22 μm 微孔滤膜除菌制备模拟肠液[10]。将0.5 mL菌悬液加至4.5 mL模拟胃液或肠液[9]中37 ℃孵育3 h，利用平板计数法分别测定0 h及3 h时的菌数，以菌株的存活率评估植物乳杆菌对模拟胃肠液的耐受能力，计算如公式(1)所示。植物乳杆菌的自聚集和共聚集能力测定参考COLLADO等[11]的方法。将1 mL菌悬液旋涡振荡10 s后37 ℃孵育5 h，轻取200 μL上层悬液，测量OD600值(A2)，A1为初始菌悬液的吸光值，自聚集能力计算如公式(2)所示。将等体积的乳杆菌与大肠杆菌和沙门氏菌菌悬液分别混合，涡旋振荡10 s后37 ℃孵育5 h，轻取200 μL上层悬液，测量OD600值(A5)，A3和A4分别为受试菌与致病菌菌悬液单独处理5 h的吸光值，共聚集能力计算如公式(3)所示。参照BURNS等[12]的方法，并稍作改动，取2 mL菌悬液于3支5 mL离心管中，依次加入2 mL二甲苯和乙酸乙酯，涡旋振荡2 min后在通风厨中静置30 min，水相的吸光值(A2)和初始菌悬液吸光值(A1)计算如公式(4)所示：

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3 基因组DNA重测序

菌株在37 ℃、250 r/min培养12 h后，采用磁珠法进行基因组DNA提取，用于基因组文库构建。对测序得到的原始数据进行质量评估后，使用BWA将样本有效数据比对到参考基因组上，利用GATK的Haplotype Caller分析样品和参考基因组之间的基因型差异，并使用SnpEff软件根据参考基因组的注释信息对突变进行注释和分析。

1.4 重要功能基因实时荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)验证

使用RNApure Bacteria Kit试剂盒提取mRNA，去除基因组DNA、反转录和qRT-PCR用到的试剂盒分别是HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture，购自康为世纪生物科技有限公司。以乳杆菌cDNA为模板，16S作为内参基因，乙酸激酶(ack1)、丙酮酸羧化酶(pycA)、L-乳酸脱氢酶(ldhl2)、磷酸果糖激酶(fruK)、磷酸转乙酰酶(pta)、丙酮酸脱氢酶系E1(pdhA)和丙酮酸脱氢酶系E2(pdhC)为目标基因，根据2-ΔΔct方法计算基因相对表达量[13]。所有的引物由金唯智生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物

2 结果与分析

2.1 体外益生特性评价

植物乳杆菌为宿主提供有益效果的前提是通过胃的酸性环境和肠液中的高胆汁盐环境，以活菌状态达到肠道。研究表明菌株的耐酸和胆盐的胁迫主要与谷氨酸脱羧酶系统、氨的产生和表层蛋白的影响等相关[14]。已有研究报道WCFS1具有较好的胆盐耐受力，在体外模拟胃肠液中表现出较高的存活率，以及在健康志愿者体内都显示出较高的存活能力[15]。随着pH的降低，WCFS1和DY6的存活率快速下降(图1-a)，在不同酸性环境下两株菌的存活率无显著差异，说明DY6与WCFS1的耐酸性相当；在不同质量浓度的猪胆盐胁迫4 h后，DY6菌株存活率均略高于WCFS1，在0.6%(质量分数)猪胆盐条件下依然能保持30%以上的存活率(图1-b)。通过人工配制胃液及肠液模拟益生菌进入人体后在肠胃中所处的消化环境，研究发现DY6在模拟胃液和肠液中的存活率均高于WCFS1，表明DY6对于耐受胃肠环境同样具有较强的优势地位。

胃的低pH环境和胃蛋白酶的共同作用也是抗菌的有效屏障，体内乳酸菌通过与病原菌共聚，使其在密切相互作用中释放出抗病原体的物质，进一步防止肠道病原体黏附和肠道定殖，通常与细胞表面黏附蛋白有关[16]。本研究发现DY6的自聚集能力是WCFS1的1.58倍(图1-d)，DY6和WCFS1分别与大肠杆菌和沙门氏菌的共聚集能力略高于DY6(图1-e)，表明DY6在抑制病原菌的生长同样具有优势。乳酸菌的疏水性与细胞表面黏附性存在正相关，本研究中采用二甲苯和乙酸乙酯检测表面疏水性[14]。与二甲苯相比，两株菌对乙酸乙酯的疏水性最佳(图1-f)；与WCFS1相比，DY6的疏水性能较差，因此WCFS1可能具有更佳的肠道上皮细胞黏附能力。

2.2 DY6和WCFS1的发酵特性评价

2.2.1 DY6和WCFS1的发酵特性

植物乳杆菌在利用葡萄糖发酵过程中的关键作用是产生具有防腐作用的乳酸和乙酸等，这些有机酸的积累导致pH值急剧下降，是抵御病原体的主要机制[2]。WCFS1基因组编码的糖酵解和磷酸酮酶途径的全部酶都属于潜在的高表达基因类型，并且丙酮酸的代谢能力更强，产生较多的其他代谢产物如乳酸、乙酸和甲酸等[17]。图2-a和图2-b表示DY6和WCFS1以葡萄糖为唯一碳源的生长和代谢差异情况，整个发酵过程中DY6的生长性能优于WCFS1，发酵终点时OD600值相差25.27%。由于高数量和高活性的植物乳杆菌活菌是定植胃肠道发挥益生作用的前提，而DY6拥有优异的生长活性使菌株能够更多的抵达肠道，进而才能通过合成抗菌物质和与其他菌群和宿主互作等方式维持肠道健康。植物乳杆菌产酸能力同样是衡量菌株发酵活性的重要指标，DY6的乳酸产量比WCFS1高17.5%，并且发酵过程中DY6的乳酸糖酸转化率比WCFS1更高。其中在8～12 h时，DY6的糖酸转化率超过100%，表明菌株可以利用其他化合物转化为乳酸。乳酸产量明显增加的直接效应是周围环境的pH值的降低，进而能够抑制病原菌生长。DY6在以葡萄糖为碳源时的优异产乳酸性能可能与乳酸脱氢酶调控的乳酸合成途径有直接关系。此外，两株菌产生少量乙酸可能是由于葡萄糖限制导致丙酮酸转化为乙酸，WCFS1发酵终点的代谢产物中乙酸的产量比DY6高了21.84%，推测是WCFS1的其余碳源主要流向乙酸，并导致乳酸的产量低于DY6，或者DY6代谢中产生的乙酸被机体消耗或合成其他物质。植物乳杆菌发酵产生的其他有机酸除了降低pH的作用外，在改善心血管代谢性疾病、维持健康血压等方面也具有积极作用。DY6代谢产物中还有少量的其他有机酸如苹果酸、草酰乙酸和丁酸，分别比WCFS1高了5.95%、69.54%和19.31%，丙酸比WCFS1低了7.87%。总之，DY6从整体上表现出具有较强的生长活性和产酸能力。然而，为最大限度的开发和利用菌株，还需要从基因层面对DY6的生长和发酵代谢特性相关机制做深入的研究。

2.2.2 DY6和WCFS1的碳源利用研究

乳酸菌属于化能异养型微生物，缺乏对许多有机化合物的合成能力，菌株能否在不同环境下进行代谢活动很大程度上取决于营养物质的供给，因而不同碳源的培养基是影响菌株代谢的重要因素之一[18]。研究表明植物乳杆菌WCFS1可以有效代谢多种碳水化合物，并产生大量乳酸，在制备低糖酸奶等应用中显示出巨大潜力[8]。为研究植物乳杆菌DY6对不同碳源的利用情况，以蔗糖(图2-c)、半乳糖(图2-d)、果糖(图2-e)和麦芽糖(图2-f)作为唯一碳源分别培养DY6和WCFS1。发现表型差异最明显的是果糖为碳源时，两株菌的乳酸产量和OD600值分别相差3 387.22%和69.22%，表明DY6具有优异的果糖代谢能力，能够为菌株的生长提供能量。利用果糖为碳源时，除有机酸外还能产生其他高附加值产物，如甘露醇和山梨醇等。DY6在果糖代谢中碳源主要用于乳酸的生产，推测催化果糖磷酸化的果糖激酶对调控DY6的生长和代谢起着重要作用。半乳糖代谢中两株菌的乳酸产量和OD600值分别相差46.98%和1.41%，推测半乳糖进入Leloir途径后碳源主要用于乳酸的生产。麦芽糖和蔗糖代谢中DY6的乳酸产量和生长情况略高于WCFS1。DY6代谢产物中乙酸、柠檬酸、苹果酸等其他有机酸含量基本都低于WCFS1，推测DY6代谢中碳源主要用于菌株的生长和乳酸的产生。基于DY6在利用碳水化合物方面表现出更高的效率和更强的能力，表明菌株在富含果糖和半乳糖的碳水化合物的环境中的适应能力更强。

2.2.3 DY6和WCFS1的氨基酸代谢差异

富含氨基酸的有机氮源具有调节胞内pH、提供营养成分的合成前体和产生代谢能量或氧化还原能力等多种作用，因此氨基酸的合成和分解直接影响菌体的耐酸性能、生长代谢和发酵产品特定风味的形成[19]。与WCFS1相比，DY6的精氨酸(1 036.03%)和天冬氨酸(488.83%)的需求量最为显著(图2-g)。精氨酸分解代谢途径主要是精氨酸脱氨酶途径(arginine deiminase pathway,ADI)，由精氨酸到鸟氨酸、氨气和二氧化碳的转化，同时产生ATP。当产能营养物质耗尽时，DY6大量消耗精氨酸生成的ATP可能用于延长细胞的存活时间。此外，ADI途径也是菌体进行pH自我平衡的机制之一，代谢产生氨气与胞质氢离子结合生成铵根离子，从而使pH升高。推测大量消耗的精氨酸对菌株较好的耐酸性能有积极的促进作用。天冬氨酸通过天冬氨酸脱羧酶等酶进行催化产生乙偶姻、富马酸等产物，形成的脱羧反应作为能源来源和外边酸性的pH保护系统。谷氨酸的脱羧反应也是增强细胞耐酸性的途径之一，谷氨酸代谢消耗氢离子产生γ-氨基丁酸，使pH得到提升。DY6消耗的谷氨酸(86.18%)显著低于WCFS1，WCFS1能够产生大量γ-氨基丁酸86.44%，同时也提高了菌株对酸的耐受性。此外，甲硫氨酸(72.16%)的需求量明显低于WCFS1，可能影响甲基的供给和甲基化反应。DY6的缬氨酸(80.52%)生产能力最强，有利于提高发酵中挥发性风味物质的产量。

a-发酵过程中的生长和有机酸生产水平;b-单位干重乳酸产量;c～f-蔗糖、半乳糖、果糖、麦芽糖分别为唯一碳源时DY6和WCFS1的菌株差异;g-DY6和WCFS1氨基酸代谢情况差异

2.3 DY6全基因组重测序

2.3.1 变异位点检测和注释

结合植物乳杆菌DY6基因组重测序数据(表2)与参考基因组(NC_004567.2)之间比对的结果，发现植物乳杆菌DY6样品的差异基因的位点共20 368个，其中SNP 19 396个，INDEL 972个，注释到的差异基因有4 331个，突变类型包括移码框未改变的插入(84个)、移码突变(190个)、终止密码子丢失和拼接区变异(62个)、错义突变(3 990个)和起始密码子丢失(5个)，DY6中主要是发生错义突变。

表2 基因组重测序数据统计

2.3.2 KEGG通路变异基因富集分析

在KEGG数据库中植物乳杆菌DY6共注释到的基因数目为1 350个，变异基因数目为701个，注释的通路为27个，包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢和机体系统五个方面(图3-a)。在新陈代谢方面占比超过一半，注释的13个通路主要包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢和维生素代谢等。其中碳水化合物代谢途径注释的基因数目最多，主要包括丙酮酸代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、磷酸戊糖代谢等，在基因水平上显示出菌株利用碳源进行能量代谢和转化中间产物的潜力。此外在氨基酸代谢途径中注释到82个基因，包含蛋氨酸、天冬氨酸和精氨酸等代谢途径。

2.3.3 丙酮酸代谢途径解析

乳酸菌的整个代谢过程主要是从糖中快速并且最大限度地生产乳酸等其他代谢产物的关键控制点在糖酵解中的丙酮酸代谢。本研究注释到DY6中丙酮酸相关代谢途径的大量基因(图3-b)，fruK作为糖酵解途径的限速变构调控酶，其酶活的高低可根据细胞对能量的需要进行调节，从而控制糖酵解代谢流和生长速率。DY6的生长活性显著高于WCFS1，推测DY6代谢中fruK可能存在正突变，加快葡萄糖碳源流向糖酵解途径，满足细胞生长所需的能量和物质。此外，DY6代谢中丙酮酸通过Idhl2产生的乳酸含量明显优于WCFS1，通过pta和ack1催化产生的乙酸低于WCFS1，由于其余有机酸含量显著低于乳酸和乙酸，推测ldhl2可能存在正突变，使丙酮酸代谢流向乳酸代谢增多。丙酮酸通过pycA转化为草酰乙酸后，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳，磷酸烯醇式丙酮酸水平的增加可以加强糖酵解的阻滞，降低葡萄糖摄取率，pycA和pck的基因变化是否对菌株的影响还需要进一步试验证明。丙酮酸脱氢酶系催化丙酮酸到乙酰辅酶A是糖的有氧氧化和氧化磷酸化的连接结点，在能量代谢中起着重要的作用，催化该反应的pdhC中插入一段序列为LysAlaGluThrProAlaAla，以及pdhA中存在一个差异基因，但这些差异基因的变化是否导致了生长和代谢产物的变化则还需要进一步试验证明。

2.3.4 碳水化合物代谢途径解析

碳水化合物代谢能力是细菌培养和选择的重要指标，乳酸菌利用多种碳水化合物的能力是居住在胃肠道或能够居住在各种生态位的生物体的一个重要属性[20]。乳酸菌利用磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)将单糖和双糖转运到细胞内代谢，WCFS1中编码25个完整的PTS酶Ⅱ复合物(EⅡ)和几个不完整的复合物，远远超过在其他微生物基因组中发现的PTS数量[17]。DY6中注释到26个PTS转运蛋白的EⅡ共发生93个突变位点。丰富的PTS转运载体对植物乳杆菌DY6的碳源利用极为重要，这可能也是DY6具有优越的产酸和耗糖性能的重要原因。推测PTS中存在正向突变，使其具有较强的碳水化合物转运能力，提高菌株在复杂环境中碳水化合物的利用率。DY6在果糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖代谢途径中注释的基因如图3-b所示。果糖激酶属于一种磷酸转移酶，催化果糖形成果糖-6-磷酸后进入糖酵解途径。由于果糖可以绕开糖酵解入口的己糖激酶和磷酸果糖激酶的限速酶，进而不受其他多种因素的严密调节，可以迅速进入代谢途径，并且与葡萄糖氧化放出的能量相同[21]。结合DY6在果糖代谢中表型差异最为显著，推测果糖激酶(sacK1、sacK2)、果糖特异性EIIABC(fruA)和EIIBC(PTS31BC)组分可能发生正突变，加快碳源流向乳酸的合成。乳糖经β-半乳糖苷酶(lacA)的作用下被水解为葡萄糖和半乳糖，随后这两种单糖分别进入糖酵解途径和Leloir途径。乳糖的不彻底分解造成的半乳糖积累，半乳糖的存也会影响发酵乳制品的品质和烘培制品的风味[22]。DY6中注释到D-半乳糖进入Leloir途径后，经醛糖1-表异构酶(galM)等酶催化生成UDP-葡萄糖后转变为葡萄糖-1-磷酸进入糖酵解途径中。DY6利用半乳糖具有较好的产乳酸性能，推测可能存在正突变加快半乳糖水解。蔗糖-6-磷酸水解酶(scrB)和α-葡萄糖苷酶(Ip_0193)分别水解蔗糖和麦芽糖为单糖，结合菌株表型代谢中的差异，推测scrB和Ip_0193可能存在正向突变，加快碳源代谢。

2.3.5 氨基酸代谢途径解析

不同乳酸菌菌株由于其代谢路径不完全相同，对其生长所需要的必需和非必需氨基酸的数量和类型也就不同，而氨基酸的合成分解又直接影响菌体的生长代谢。甲硫氨酸是生命体所必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，为肌酸等转甲基化反应、DNA等甲基化提供甲基及抗氧化防御[23]。甲硫氨酸和半胱氨酸的合成和代谢中注释的差异基因有蛋氨酸腺苷转移酶(metK)和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酸酶(mtn)等酶(图3-b)。在对数生长期中催化同型半胱氨酸合成甲硫氨酸所编码的酶表达量具有明显的上调，与甲硫氨酸生物合成相关的酶对菌株生长具有显著影响[24]。结合甲硫氨酸消耗量较少推测可能是metK或mtn发生负突变造成甲硫氨酸代谢途径抑制。谷氨酸脱羧酶(gadB)对L-谷氨酸具有专一性，在磷酸吡哆醛作为其辅酶因子的条件下，催化L-谷氨酸进行不可逆的α-脱羧反应合成γ-氨基丁酸。结合DY6的γ-氨基丁酸产生量低于WCFS1，推测gadB可能发生负突变，影响γ-氨基丁酸的合成，从而对菌株的耐酸性能产生影响。谷氨酸是其他氨基酸合成的关键中间体，在谷氨酸脱氢酶(gdh)催化下产生柠檬酸循环的中间代谢产物α-酮戊二酸和氨气，并释放能量。L-谷氨酸和谷氨酰胺代谢途径中注释到在氨甲酰磷酸合成酶(carB)和鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)等酶的催化下合成瓜氨酸。L-瓜氨酸和L-天冬氨酸共同反应得到L-精氨琥珀酸，随后在精氨琥珀酸裂解酶(argH)催化下生成延胡索酸和精氨酸，后者继续反应生成鸟氨酸参与反应。DY6的精氨酸大量消耗推测可能是argF发生正突变，造成精氨酸迅速被代谢。

a-KEGG通路变异基因功能注释;b-果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖和氨基酸代谢途径;c-qRT-PCR测定丙酮酸代谢相关基因表达水平

2.4 对丙酮酸代谢相关突变基因的qRT-PCR验证

为了在基因转录水平上解释其发酵差异，选取产有机酸关联紧密的丙酮酸代谢途径(图3-b)，对该过程中注释的7个关键酶(pdhC、ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA)的基因表达量进行测定。以WCFS1的基因表达量为1作为标准，发现pdhC基因相对表达量最高，是WCFS1的20倍。此外ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA的表达水平依次是WCFS1的15、14、7、6、3、2倍(图3-c)。ack1和Idhl2的基因表达情况与表型中乙酸和乳酸产量差异变化相一致，pdhC基因相对表达最为显著，推测可能是该序列中插入一段LysAlaGluThrProAlaAla，与其结构和催化活性相关，进而影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。

3 结论

植物乳杆菌是一种具有良好生理特性及益生功能的细菌，被广泛应用于食品、动物饲料、工业生产和医疗保健等领域。但早期的研究主要集中在单一菌株的表型特征，如碳水化合物、生长温度和pH等方面的生长特性研究，以及多菌株的分类学、系统发育研究和食品安全性评估等方面，缺少与优秀模式菌株的表型关联分析。通过分析同种不同来源的菌株的性状差异，在基因水平上进一步揭示植物乳杆菌的菌种特性、生理功能和代谢机制。本研究经过体外益生特性试验表明DY6拥有与WCFS1同样较强的耐酸、耐胆盐和与致病菌的共聚集性能，表明DY6可作为潜在的益生菌株进行进一步研究。此外，在富含葡萄糖、果糖和半乳糖的培养基中DY6的生长和代谢情况显著优于WCFS1，产乳酸性能显著优于WCFS1。随后发现，在DY6基因组中与丙酮酸代谢关联的pdhC、ack1和Idhl2的基因表达量具有显著优势，推测可能编码了非常强的丙酮酸代谢能力，与其发酵过程产酸快、产酸强直接相关。本研究中依据基因组重测序获取了大量差异基因，并全面关联到与表型差异相关的代谢途径的所有基因，为后续以植物乳杆菌为模式菌株进行代谢机制研究提供了理论支撑。