微小核糖核酸495及微小核糖核酸200b基因多态性与大动脉粥样硬化型卒中发病年龄的关联分析

2022-10-03秦山梅沈冲汤武装林颖王昭君张治中刘新峰

中国脑血管病杂志 2022年3期

秦山梅沈冲汤武装林颖王昭君张治中刘新峰

卒中已成为我国居民死亡的第3位病因[1]。70%以上的卒中是缺血性卒中，其中以大动脉粥样硬化型(large artery atherosclerosis，LAA)最常见，且该型更易受遗传因素的影响[2]。有研究证实，基因多态性与LAA缺血性卒中密切相关[3]。

微RNA(micro-ribonucleic acid，miRNA)可通过部分抑制信使RNA或降解靶向的信使RNA，使靶基因转录后发生基因沉默[4]。在缺血性卒中发生发展的过程中，存在大量特异性miRNA差异性表达， miRNA可能成为缺血性卒中诊断及对高危人群评估的生物学标志物。研究显示，miRNA-495及miRNA-200b参与了动脉粥样硬化、血小板聚集与活化、新生血管形成等病理生理过程[5-8]。miRNA-495及miRNA-200b的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)会导致相应的miRNA及其靶基因失调，进而影响缺血性卒中的发生发展[9]。目前，对于miRNA-495及miRNA-200b的SNPs与缺血性卒中发病年龄的相关性尚未明确，因此，本研究拟对miRNA-495及miRNA-200b的基因多态性与LAA缺血性卒中发病年龄的关联进行探讨，以期为缺血性卒中高危人群的病因预防及早期筛查提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象

连续回顾性纳入2009年5月至2017年12月江苏省宜兴市人民医院神经内科LAA缺血性卒中住院患者697例，其中男429例，女268例；年龄39～82岁，平均(66.0±9.8)岁。本研究方案经东部战区总医院伦理委员会批准(伦理号：2017NZGKJ-041)，患者或其家属签署了诊疗知情同意书。

纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)首次缺血性卒中，根据急性卒中Org 10172治疗试验(trial of Org10172 in acute stroke treatment，TOAST)分型诊断为LAA型[10]，并经影像学证实。排除标准：(1)既往卒中、短暂性脑缺血发作史；(2)病历资料不完整；(3)合并有其他系统严重疾病。

1.2 研究方法

记录患者的基线资料，包括人口学特征(年龄、性别)、心脑血管疾病危险因素(高血压病、高脂血症、糖尿病)、不良嗜好(吸烟、饮酒史)。高血压病、高脂血症、糖尿病的评价分别参照国内相关指南的标准[11-13]。吸烟史及饮酒史通过查阅病历资料获得。

1.3 易感基因多态性检测及基因分型

通过NCBI dbSNP数据库及既往文献[9，14]，筛选出与LAA相关的2个基因(miRNA-495及miRNA-200b)中的2个SNPs位点，分别为rs2281611及rs7549819。

入院后次日清晨采集所有患者的空腹外周静脉血5 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，离心后取下层红细胞，-80 ℃冰箱保存。由上海天昊生物科技有限公司采用SNPscan法对rs2281611、rs7549819进行基因分型。为评价基因分型的可靠性，随机挑选部分样本进行重复验证，检测结果符合率为100.0%。

依据rs2281611、rs7549819多态性基因分型，累计突变等位基因的个数，即患者基因型中所含2个SNPs突变等位基因(miRNA-200b C及miRNA-495 G)的个数之和。根据基因型中突变等位基因个数和，将患者分为3组，突变等位基因总数分别为0个(不携带突变等位基因)、1～2个、3～4个。

为了避免不同年龄段可能对结果带来的影响，本研究先对年龄进行了分层分析，miRNA-200b rs7549819在59岁患者中不同基因型交叉最多(Log-rankχ2=5.546，P=0.019；图1)，并结合世界卫生组织的年龄划分标准[15]，故本研究将LAA缺血性卒中患者分为中青年(年龄<59岁)、老年(年龄≥59岁)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 基线资料比较

697例LAA缺血性卒中患者中，无高血压病史者平均发病年龄低于高血压病史者，有吸烟史及饮酒史患者平均发病年龄低于无吸烟史及饮酒史者，差异均有统计学意义(均P<0.05)；其余基线资料平均发病年龄的差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.2 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819多态性与LAA缺血性卒中发病年龄的关联

在miRNA-495 rs2281611的共显性模型中，TT、TG、GG型患者平均发病年龄的差异有统计学意义(F=4.224，P=0.015)，与TT型和TG型患者相比，GG型患者平均发病年龄更早，两两比较的差异均有统计学意义(P值分别为0.036、0.004)，TT型和TG型平均发病年龄的差异无统计学意义(P=0.639)；在其隐性模型中，GG型患者平均发病年龄早于TT+TG型(P=0.004)；在其显性模型中，TT型与TG+GG型平均发病年龄的差异无统计学意义(P>0.05)。miRNA-200b rs7549819各遗传模型中患者平均发病年龄的差异均无统计学意义(均P>0.05)。在共显性和隐性模型中，携带miRNA-495 rs2281611 GG型患者发生LAA缺血性卒中的发病风险更高(共显性：HR=1.40，95%CI：1.12～1.74，P=0.003；隐性：HR=1.35，95%CI：1.13～1.62，P=0.001)。见表2。对miRNA-200b rs7549819隐性模型分析显示，在年龄≥59岁的老年患者中，与TT+TC型相比，CC型LAA缺血性卒中发病风险增加了38.0%(HR=1.38，95%CI：1.08～1.77，P=0.009)，且CC型患者发病年龄会更早(Log-rankχ2=9.579，P=0.002)；中青年患者中CC型携带者LAA缺血性卒中发病风险则呈降低趋势，但差异无统计学意义(HR=0.73，95%CI：0.45～1.18，P=0.193)，且与CC型患者发病年龄的差异无统计学意义(Log-rankχ2=1.651，P=0.199)。见图2。

表2 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819多态性与697例大动脉粥样硬化型缺血性卒中发病年龄的关联分析

rs7549819 T>C基因型例数[例(%)]发病年龄(x-±s,岁)检验值P值HR值e95% CIP值共显性0.712c0.4910.161 TT282(40.5)66.0±10.01.00-- TC318(45.6)66.3±10.00.950.81～1.120.570 CC097(13.9)64.9±08.81.190.95～1.510.136显性0.085d0.932 TT282(25.3)66.0±10.01.00-- TC+CC415(74.7)66.0±09.71.000.86～1.170.982隐性1.152d0.250 TT+TC600(77.0)66.2±10.01.00-- CC097(23.0)64.9±08.8 1.230.99～1.520.068

2.3 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819突变等位基因数量与LAA缺血性卒中发病年龄的关联

697例患者总体情况显示，随着携带累计突变等位基因数量的增加，LAA缺血性卒中患者平均发病年龄呈下降趋势，携带0、1～2、3～4个累计突变等位基因LAA缺血性卒中患者发病年龄的差异有统计学意义(F=4.108，P=0.017)；与携带3～4个突变等位基因患者比较，携带0、1～2个突变等位基因LAA缺血性卒中患者发病年龄的差异均有统计学意义(P值分别为0.016、0.012)，携带0个与1～2个突变等位基因患者发病年龄的差异无统计学意义(P=0.331)。与不携带突变等位基因患者相比，携带3～4个累计突变等位基因患者LAA缺血性卒中发病风险增加了41.0%(P=0.029)。对不同性别、年龄段LAA缺血性卒中患者发病年龄进行分析显示，携带3～4个累计突变等位基因的女性及老年患者LAA缺血性卒中发病风险显著增加(均P<0.05)，但该结果在男性及中青年患者中差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

3 讨论

本研究探讨了miRNA-495 rs2281611、miRNA-200b rs7549819多态性与LAA缺血性卒中发病年龄之间的关联，结果显示，携带miRNA-495 rs2281611 GG型患者的LAA缺血性卒中发病年龄更早，而miRNA-200b rs7549819 CC型与老年患者LAA缺血性卒中发病年龄提前相关，同时，这2个SNPs突变等位基因累计个数是影响LAA缺血性卒中发病年龄的独立危险因素，携带3～4个突变等位基因患者的LAA缺血性卒中发病风险显著增加，该结果在女性及老年患者中更显著。

大部分LAA缺血性卒中是由动脉粥样硬化斑块破裂及继发血栓形成所致，使脑血流灌注不足，从而引起相应缺血区的脑组织功能障碍。既往研究表明，miRNA-200b、miRNA-495在上述病理生理过程中参与了调控[6，16]。缺氧时，miRNA-200b可抑制内皮型一氧化氮合酶的表达，限制一氧化氮的生物利用度，内皮细胞代谢紊乱引起其功能障碍[5]。miRNA-200b表达水平升高会导致三磷酸腺苷结合盒转运体A1水平下调，加速了动脉血管壁细胞脂质积累，并抑制胆固醇逆转运，促进泡沫细胞形成，从而加速动脉粥样硬化的进展[16]。miRNA-495可抑制趋化因子配体2的表达，影响内皮细胞增殖和迁移通路，参与动脉粥样硬化的进程[17]。在血管再狭窄模型中，诱导miRNA-495表达沉默可抑制内膜增生，减少动脉血管壁细胞中巨噬细胞的数量，从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成，并增加斑块的稳定性[6]。

血小板与动脉粥样硬化斑块破裂后继发的血栓形成密切相关[18]。miRNA-200b和miRNA-495可通过分别靶向蛋白激酶环磷酸腺苷依赖性Ⅱ型调节亚基β和Kelch样蛋白5，从而干扰血小板的激活和聚集[7]。与静息血小板相比，miRNA-495在受凝血酶刺激的血小板中表达水平上调[19]。miRNA-200b和miRNA-495失调会导致血小板表达水平及其反应性的改变，继而影响血栓形成的过程。

rs2281611、rs7549819的位点均位于基因启动子区，其发生突变能够直接影响miRNA-495和miRNA-200b基因的转录，并干扰突变位点相关转录因子的结合过程，基于上述miRNA-495和miRNA-200b在动脉粥样硬化进展[5-6，15-16]和继发血栓形成[7，18]等方面重要的调控作用，rs2281611、rs7549819位点突变可能会通过干扰相应miRNA及其靶基因的合成或调节过程，从而影响缺血性卒中的发生发展[9]。既往研究表明，老年人群大动脉粥样硬化负担随着年龄的增加而加重[20]，而青年缺血性卒中的主要危险因素为吸烟、饮酒、腰臀比和心理社会因素等[21]，且绝经后女性表现出更高的动脉粥样硬化斑块破裂的风险[22]。本研究结果与文献报道一致，提示rs2281611、rs7549819的多态性可能具有早期识别LAA缺血性卒中高风险人群的潜能。但rs2281611、rs7549819与LAA缺血性卒中患者发病年龄关系的具体生物学机制有待进一步探讨，本研究结果仍需后续的研究进行验证。