缺血性脑卒中非人灵长类动物模型研究进展

孙宇航管博文魏 强孟爱民

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,国家人类疾病动物模型资源库,北京 100021)

脑卒中有较高的发病率和致残、致死率,其中缺血性脑卒中占85%左右。1990年到2019年,全球脑卒中患病人数、死亡人数和伤残调整寿命年逐年上升,造成了严重的疾病负担[1]。为满足临床对缺血性脑卒中的防治需求,建立了多种动物模型用于机制研究及干预措施的评价。目前广泛使用啮齿类动物,通过阻塞大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)构建缺血性脑卒中模型。这类模型具有许多优点,如成本低、易操作、生理反应特性好、能够研究遗传信息和共病(如糖尿病、高血压)等[2],但所有在啮齿动物脑卒中模型中有效的神经保护策略都未能成功转化到临床。NHPs与人类在脑血管系统、脑代谢、灰质与白质比例以及认知和行为的复杂性等方面高度相似,使其可能比其他类型动物更适合模拟人类神经系统疾病[3]。本文对缺血性脑卒中NHPs模型进行了总结,并与传统啮齿类模型进行比较分析,这对于了解各种模型的优缺点,根据实验的具体条件和目的选择最佳NHPs模型至关重要。

1 常用缺血性脑卒中动物模型

脑卒中研究中最常用的是啮齿类动物模型,这类模型成本低,操作方便,伦理标准完善,近年来转基因技术的发展也使小鼠模型具备了更多优势。但啮齿动物在脑梗塞后只会出现暂时性偏瘫,康复过程中恢复很快[4],且生理条件、大脑解剖结构和血管血液供应方面与人类有很大不同。缺血性脑卒中作为一种复杂疾病,梗死体积和神经系统功能缺失的严重程度取决于多种因素,如有无侧支循环建立和有无足够的血压保持灌注,梗死的病因及部位,年龄、性别、遗传背景,是否有并发症,是否经过药物治疗等。已经构建了多种模型用于各种影响因素的研究(表1),对阐明脑卒中的分子、细胞和系统病理生理学机制发挥了重要的作用。然而,由于啮齿类动物缺血性脑卒中模型临床前研究成果向临床转化困难,需要构建与人类脑卒中相似性更高的模型以提高临床转化率。

表1 常用缺血性脑卒中动物模型Table1 Commonanimalmodelsofischemicstroke

2 NHPs脑卒中模型的优势和必要性

为了解决啮齿类动物和人类之间的差异导致的治疗反应性的差异,2009年脑卒中治疗学术企业圆桌会议(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable,STAIR)建议首先选择啮齿类动物脑卒中模型进行初步研究,灵长类动物或猫作为第二物种开展后续试验[8],以提高临床前研究的转化能力。

2.1 解剖学相似性

NHPs具有与人类相似的复杂脑部结构及血管系统。目前建立缺血性脑卒中模型的NHPs可分为缺脑回型(皮层光滑)如绒猴、松鼠猴等,以及多脑回型(皮层有卷曲的脑沟和脑回)如狒狒、恒河猴、非洲绿猴以及食蟹猴等。与缺脑回型相比,多脑回型NHPs脑结构,特别是管理运动和感觉功能的大脑皮层结构,以及灰质与白质的比例(＞60%)与人类更为相似[3]。研究发现,白质缺血性损伤是影响人类脑卒中预后的重要因素,NHPs在脑缺血后灰质和白质的变化以及功能损伤方面比其他中风动物模型更近似人类,因此可以解决无白质结构的啮齿类动物无法复制白质损伤的问题[9]。此外,NHPs具有与人类相似的脑血管系统、颈内动脉和椎动脉分布,以及丰富的侧枝循环系统,M1栓塞主要导致基底节和白质缺血;而啮齿类动物由于侧支循环与人类差异较大,MCA梗塞后损伤部位和性质都有不同[10];猫、犬、绵羊、猪等由于许多分枝构成血管网结构(rete mirabile),不适合制备大脑中动脉阻塞模型[3]。

2.2 病理生理学相似性

NHPs脑卒中模型在免疫应答、血栓组成和梗死区域方面与人类相似性高。NHPs免疫成分与人类相似性较啮齿类更高,脑卒中后可引发相似的免疫反应,针对人类脑卒中相关蛋白质/表位的免疫试剂,可以直接用于NHPs的相关检测,但其他低等哺乳动物通常不适用[11]。其次,啮齿类动物的血小板缺乏人类普遍表达的血小板激活因子受体,在人类和灵长类动物MCAO过程中,缺血区发生中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte)聚集,但尚未在大鼠中发现该现象,而大鼠白细胞表面表达的整合素α4ß1也未在 人 类和NHPs细 胞上 发现[10]。NHPs的血管止血成分主要包括血小板、血浆凝血蛋白、纤溶蛋白和抑制蛋白等,与人类脑血管中血栓成分更相似[12]。此外,多脑回型NHPs脑部体积更大,结构更复杂,其大脑比大鼠大5倍,约占其体重的2.7%,相当于人类的比例,适于针对性地观察不同区域损伤对预后的影响。Ramirez-Garcia等[13]将食蟹猴大脑MCAO半球分成50个相关区域,发现额叶、颞叶、枕叶、中白质、内囊、颞叶上回、颞叶中回和尾状核损伤均会导致模型评分差异,更符合人类脑卒中的复杂情况。因此,NHPs脑卒中模型可以更全面地模拟人类脑卒中后病理生理变化。

2.3 检测和评价方法相似性

NHPs有很强的学习记忆能力和执行复杂行为任务的能力,在感觉和运动功能方面与人类更为相似,进行神经行为测试时能更有效模拟临床评价指标[14]。此外,NHPs上肢结构与人类相似,在手部精细动作功能研究中具有不可替代的作用,故NHPs模型可用于研发各种手灵巧任务(hand dexterity task)相关的临床评价手段,检测脑卒中的功能损伤及干预效果[15]。NHPs的体型适用于人类临床影像检测技术,如计算机断层扫描(CT)、脑正电子发射断层扫描(PET)、脑磁共振成像(MRI)和血管造影(DSA)等,其中MRI对缺血性脑卒中发现早,敏感性高,是目前临床广泛使用的检测手段。卒中后残存行为能力与基于MRI成像的脑功能连接(functional connectivity,FC)变化关系密切。Hernandez-Castillo等[16]应用食蟹猴MCA卒中模型研究发现3个FC变化与行为显著相关,同侧FC减少与恢复不良相关。这提示NHPs脑卒中模型中静息状态网络的分析可以成为脑卒中转化医学领域的一种相关研究方法,可能会作为新的药物治疗的生物标志物,用于判断卒中后神经变化情况,或者为脑-机接口的实现提供信息,以恢复脑卒中后的功能损伤。

3 建模方法及应用

构建NHPs缺血性脑卒中模型的方法可以分为手术法、血管内介入法和光化学诱导法,根据建模后能否产生再灌注,可分为永久性和短暂性栓塞模型。

3.1 外科手术法

通过手术暴露MCA的方法主要分为两种:经眶进入法和经颅进入法。外科手术模型的优点是精确地阻断了靶血管,因此可以降低病变变异程度和模型动物死亡率[17]。然而,侵入性手术产生的创伤会影响模型应用,而人类缺血性脑卒中通常与头部创伤无关,且开颅手术与经眶手术不仅操作难度大,对动物心理生理有重大影响,还会影响术后神经和运动行为的评估。

3.1.1 微血管夹栓塞法

此法可以严格控制缺血及再灌注的位置和时间,但手术难度大,易引起血管痉挛和脑部循环障碍等问题。Meloni等[18]采用右侧翼点开颅术,在食蟹猴眶额支远端用5 mm钛动脉夹阻断右侧MCA,通过MRI成像确定栓塞,阻断持续90 min后,取下动脉夹以恢复血流。该模型损伤可以持续数小时,恢复血流后发生了再灌注,使用该模型成功验证了聚精氨酸肽-18(poly-arginine peptide-18,R18)的神经保护作用。R18等神经肽具有多模式神经保护作用,如抗兴奋性毒物、抗炎、抗氧化和有毒分子清除、抗蛋白水解和线粒体稳定等。最近的三期临床实验中发现神经肽可改善急性中风血栓切除术后再灌注恢复情况,有效改善了预后,降低死亡率[19]。使用食蟹猴血管夹MCA模型,发现神经保护剂nerinetide(NA-1)能将突触后密度蛋白-95从神经毒性信号通路中解偶联,在减少中风损伤、改善灵长类动物缺血再灌注模型的恢复方面显示出前景。三期临床试验验证了进行血管内血栓切除术后NA-1的神经保护作用[19],尽管NA-1不适合已经接受溶栓的患者,但无疑为神经保护带来了新的希望。NHPs实验结果为脑卒中新型药物开发提供了可靠依据。

3.1.2 化学物质诱导法

内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一种强效的血管收缩肽,立体定向注射到大脑的靶区可以收缩局部小动脉,通过改变ET-1的浓度或体积可以调整脑损伤的范围[20],目前已构建了多种品系的大鼠及恒河猴、绒猴ET-1脑卒中模型。然而,这种方法的局限性在于不能严格控制缺血时间,且不同个体损伤程度差异大,死亡率高。Le Friec等[21]在中年绒猴初级运动皮层立体定向注射线粒体毒素丙二酸盐诱导形成局灶性病变,该方法安全、经济、易操作,丙二酸盐引起的感觉运动障碍在严重程度和持续时间方面重复性好,有利于脑卒中后慢性期的运动恢复治疗策略的研究。由于诱发性栓塞与人类脑血栓形成相似,可能适用于使用抗血小板和抗血栓药物的治疗康复研究。

近年来,干细胞疗法作为治疗中风的细胞替代疗法得到了广泛的探索,但一直存在长期植入后移植细胞的存活率较低的问题。Ge等[22]报告了一种通过NeuroD1基因治疗修复成年恒河猴缺血性脑卒中后受损大脑的体内神经再生方法,在恒河猴大脑双侧初级运动皮层每侧的六个部位显微注射ET-1,以诱导局灶性缺血性损伤构建脑卒中模型,发现基于NeuroD1基因治疗的体内细胞转化,可以通过再生新神经元使成年恒河猴模型脑组织修复。与依赖外部细胞移植的干细胞疗法相比,该基因疗法更依赖于内部神经胶质细胞来再生新的神经元,这些神经元可以在NHPs大脑中存活超过1年,这种长期存活的神经元有望有效修复脑卒中后受损的神经回路。基于NeuroD1的基因疗法在NHPs模型中的成功应用可能会缩小动物模型与未来临床试验之间的差距。

3.1.3 电凝法

常用的MCA栓塞模型有助于揭示皮质缺血对脑功能的损害,但对脑卒中患者进行影像学研究发现,白质损伤对脑卒中后运动功能恢复的影响比皮质损伤更大。电凝法建模梗死部位明确可控,较血管夹栓塞法对目标血管空间要求小,适于研究不同缺血位置对疾病的影响。Puentes等[23]建立了一种利用电凝法诱导绒猴脉络膜前动脉栓塞的方法,用于研究非人灵长类脑卒中后的白质损伤和行为变化。结果显示,用双极电凝系统切断脉络膜前动脉能诱发绒猴白质梗死并导致运动障碍,有助于深入了解白质损伤,寻找脑卒中后运动功能缺陷恢复新策略。然而,尽管绒猴在系统发育上与人类相似性较啮齿类或其他低等哺乳动物更高,但绒猴缺乏脑回,其大脑结构与人类仍有较大差异,且模型构建成功率较低,手术后约40%绒猴未出现神经损伤,可能限制该模型的进一步应用。

Ouyang等[24]使用多脑回型NHPs食蟹猴构建了电凝MCAO模型,研究脑卒中后运动功能障碍与脑内Aβ蛋白沉积的关系。研究发现中风12个月后,模型同侧丘脑和海马中没有细胞外淀粉样蛋白Aβ沉积的迹象,即Aβ斑块沉积可能不是卒中后认知障碍的病理基础,这与在啮齿动物中获得的结果相反。引起差异的原因可能是啮齿动物淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein)的结构与人类并不相似,已有研究表明 Aβ 肽不会在鼠类啮齿动物中聚集,因此本质上不会形成斑块,相反,NHPs和人类一样,脑内的Aβ 肽具有聚集和形成老年斑的能力。因此,多脑回型NHPs可以为研究脑卒中病理生理学和人类脑疾病的基本分子机制提供更适用的动物模型[25]。

早期非人灵长类脑卒中模型多利用手术方法建立,对脑卒中后缺血组织的病理生理过程及干预措施研究起到了重要作用。具有定位准确,模型重现性好,梗死成功率高等优点。但是存在着以下局限性:外科手术创伤会对动物心理产生影响;手术失败率和动物死亡率较高;容易引起神经损伤和血管痉挛;有时梗死灶的范围和体积不可预测等。

3.2 血管内介入栓塞法

血管内介入栓塞法是借助影像学成功建立局灶性脑梗塞的技术,通常是将引导导管插入股动脉并穿过胸主动脉、主动脉弓和颈总动脉到达颈内动脉,将栓子传送到MCA的特定位置以诱发局灶性缺血。常用的栓子有微导管、自体血凝块、充气球囊、弹簧线圈或手术缝合线等。此外,还可以通过导管将粘合剂直接注射到目标位置以形成栓塞,此法对目标血管闭塞完全,模型构建成功率高,但无法进行溶栓操作,不能有效模拟临床治疗过程[26]。

3.2.1 自体血凝块法

将动物自身血液凝结成的凝块输送到MCA以形成闭塞,与临床情况相似性最高,是分析取栓和溶栓最理想的动物模型,特别适于探究局部或区域输注纤溶药物、神经保护药物或新型给药方式的安全性和可行性,以及干细胞植入和脑卒中治疗后的长期生存情况。可以通过此类脑卒中模型在基因、细胞和电生理水平上进一步分析大脑神经系统疾病的发生发展机制。

Wu等[27]使用自体血栓诱导建立恒河猴脑卒中模型,通过微导管将血栓插入恒河猴右大脑中动脉M2段的末端,术后通过血管造影和MRI确认模型构建成功,使用该模型验证了鼻内递送鼠尾草素A可有效减小梗死体积,并改善神经系统预后。鼻内给药可以将药物直接输送到中枢神经系统,研究前景广阔,因NHPs给药方法和装置与人类临床情况相似,能更加准确地评估受试药物的安全性和有效性。Ramsay等[28]使用自体血栓诱导的两只雄性恒河猴卒中模型,发现了卒中前后在大脑和血液中高度差异表达的九个基因,通过测定血液转录组学,有望确定用于评估神经保护的生物标志物,以对卒中发生发展进行及时有效的表征。

3.2.2 微导管/球囊法

使用微导管或球囊构建NHPs脑卒中模型相对容易,但成本较高[29],使用固定尺寸的微导管或球囊难以阻塞不同尺寸和角度的MCA。但是,在再灌注之前或之后通过该模型中的微导管局部输注纤溶剂或神经保护药物,靶组织中药物浓度更高[30],因此可能更适用于新型药物的功效验证研究,或用于局部药物输注作为血栓切除术的辅助治疗手段研究。

Wu等[31]用16只恒河猴对比了两种血管内缺血模型的梗死面积、神经功能和生存率。与血栓栓塞组相比,微导管或球囊栓塞的动物偏瘫更为严重、梗死面积更大、Spetzler评分更低、死亡率更高。在血栓组中,血栓要么靠近注射部位(M1),要么被冲到MCA的上部(M2),未见血栓溶解。M2栓塞所有动物均存活,M1血栓栓塞组有50%的动物死亡。微导管法的优点包括栓塞部位、梗死面积易于控制,缺血诱导时间较短、缺血再灌注时间可控;缺点是梗死范围较大和MRI检测出现伪影。血栓注射法的优点包括发病机制与临床有可比性,梗死面积较小,死亡率低并且可能用于溶栓治疗的评价研究,缺点是操作技术更为复杂和难以控制栓塞确切位置。两种模型在临床上的重要差异,为进一步研究急性缺血性卒中的血栓栓塞提供了技术支撑。

3.2.3 线栓模型

该法是将一端涂有热熔性粘合剂的尼龙线插入颈内动脉,并推进至MCA构建缺血性脑卒中,可以通过抽出尼龙线诱导再灌注[32]。这种方法手术过程简单,创伤小,可以严格控制缺血时间,因此在构建啮齿类动物脑卒中模型中广泛应用。在临床上很难研究闭塞血管再通后,伴随人类大脑相关变化的细胞病理改变,NHPs线栓MCAO模型可以帮助我们更好地理解这一点。Yeo等[33]使用恒河猴线栓模型,揭示了表达CD68的小胶质细胞/巨噬细胞可能通过分泌 TGF-β引起长期抗炎作用,因此调节内源性CD68+小胶质细胞/巨噬细胞可能是潜在的治疗靶点。但临床脑卒中患者的血管栓塞通常不完全,且伴随着缓慢的自发性再灌注,进行溶栓治疗时完全溶解也需要30 min到数小时[34],与拔出线栓引起的即刻再灌注完全不同,而且用于制备模型的线栓直径对动物体重有严格的要求。这种模型不适合用于溶栓研究,但是栓塞再灌注损伤与临床血栓剥离手术治疗后的再灌注类似。

与手术方法相比,血管内介入方法对实验动物的创伤较小;模型重复性较好;直接在血管内进行阻塞,更接近于人类脑卒中的病变微环境,因此逐渐得到广泛应用。但是也存在梗死部位不精确;手术技术要求高;使用成本高等局限性。

3.3 光化学诱导法

光化学诱导法手术创伤小,死亡率低,可以控制梗死的部位、大小和程度,具有良好的可操作性和可重复性。使用大鼠构建光化学模型时,其神经功能会在诱导后2周内恢复,而在绒猴中的研究发现NHPs光化学模型恢复较慢,可导致持续的运动功能缺陷,因此更适用于研究卒中后运动功能恢复及用于临床评分标准的建立[35]。目前已经建立了食蟹猴、绒猴和恒河猴等多种光化学诱导的NHPs脑卒中模型。Yang等[36]证实circSCMH1可显著改善光化学法诱导的恒河猴脑卒中模型的神经功能损伤程度并促进运动功能恢复,从环状RNA层面揭示了缺血性脑损伤后神经功能修复的新机制,并且为环状RNA的中枢靶向递送策略研究提供了新思路。然而,光化学法诱导的梗死部位通常位于远端,溶栓剂可诱导再灌注,但再灌注时间却难以控制。

4 总结与展望

NHPs脑卒中模型经过多年发展,已经在疾病防控、机制探索、治疗及预后等研究中广泛应用。最早用于研究脑卒中的NHPs模型是经眶放置充气球囊的狒狒永久性大脑中动脉闭塞模型[2],永久性模型具有典型的脑损伤特征,常用于卒中后脑部病理生理学研究。电凝法也用于构建永久性脑卒中模型,且梗死部位明确,适用于闭塞皮质表面小血管。为了更好地了解继发性再灌注损伤和随后的微血管衰竭,NHPs缺血再灌注模型受到关注,较常用的如立体定向注射ET-1、丙二酸盐诱导血栓形成模型,适用于抗血小板和抗血栓药物的治疗康复研究;血管内介入法放置自体血凝块,是分析取栓和溶栓最理想的动物模型;使用微导管或球囊构建NHPs脑卒中模型,更适合用于神经保护药物功效评价;而使用NHPs构建线栓模型,更适用于研究脑卒中发生和再通前后脑部细胞和免疫变化。伴随着建模手段的发展,研究使用的NHPs种类也逐步增加,较早使用的缺脑回物种如绒猴、松鼠猴等多用于运动及神经功能损伤情况研究,且光滑皮层更适合进行电生理检查,多脑回物种狒狒、恒河猴、非洲绿猴以及食蟹猴等与人类更相似,可以有效评估学习运动等高级功能。然而,对于哪一种NHPs中风模型最接近模拟人类病理和生理状况,目前还没有共识[4]。

迄今为止,大多数NHPs脑卒中模型尚未考虑共病因素,例如糖尿病和高血压,构建共病模型对提升临床相关性非常重要。此外,目前的NHPs模型都主要用来研究急性期神经保护剂的效果以及再灌注引起的神经功能改变[37],但神经修复阶段的相关研究,则需要在亚急性和慢性阶段进行,此类NHPs模型标准化还需要进一步推进。值得注意的是,目前唯一一种成功转化的缺血性脑卒中治疗方法——溶栓术,其临床数据来自兔模型,而在狨猴脑卒中模型治疗中显示阳性结果的药物NXY-059,却并未在临床研究中显示出神经保护作用[3],多物种多因素的实验研究不可或缺。总之,临床前研究应着眼于将脑卒中有效治疗手段从实验室成功转化到临床,采取“啮齿类动物-NHPs-人类”的思路有望有效提升转化效率,降低治疗风险。