鸢乌贼(Sthenoteuthis oualaniensis)减菌处理及其对方斑东风螺(Babylonia areolata)摄食率影响的研究

方伟，赵旺，邓正华，陈明强，黄星美，温为庚

(中国水产科学研究院南海水产研究所， 广州 510300)

鸢乌贼(Sthenoteuthisoualaniensis)又叫深海红鱿鱼，柔鱼科(Ommastrephidae)，鸢乌贼属(Sthenoteuthis)，广泛分布于中国南海、日本群岛南部、菲律宾群岛、夏威夷等海域[1]，栖息于100 m以下的深海，是一种优质的高蛋白低脂肪海产品[2]。研究表明，台湾和夏威夷海域鸢乌贼渔业已经发展为商业性渔业。据最近的调查结果显示，南海鸢乌贼的可捕捞量已经超过500万t[3]。鸢乌贼有较强的繁殖潜力，生命周期较短，约1年，补充群体充沛，全年多季繁殖[4]。在中国南海生物资源中具有较高的开发潜力，是中国远洋主要捕捞对象[5]。因此，鸢乌贼资源应加以合理的开发和利用。

鸢乌贼肉质较硬，口感不佳，海鲜市场少见，收购价格较低，主要用于加工鱿鱼丝等休闲食品，而方斑东风螺(Babyloniaareolata)肉质鲜美、酥脆爽口，是国内外市场十分畅销的优质海产贝类，售价居高不下。目前，方斑东风螺的饲料主要是冰鲜杂鱼，其资源日渐枯竭。虽有方斑东风螺人工饲料养殖的研究报道，但未见工业化产品，主要因为鱼粉比例高，价格昂贵[6]，有必要寻找替代品。鸢乌贼携带大量的海洋微生物，其中包括海洋病原微生物及腐败微生物，此外，鸢乌贼在储存过程中也极易造成二次污染，继而影响自身的品质[7]。因此，在使用鸢乌贼作为方斑东风螺饵料前，有必要对其进行减菌化处理。本研究通过对鸢乌贼进行不同灭菌方法的预处理及投喂方斑东风螺的摄食试验的研究，不仅可以为利用鸢乌贼制作人工配合饲料提供理论基础，而且在实际生产作业中对方斑东风螺的健康养殖提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸢乌贼

试验所选用鸢乌贼均由灯光罩网渔船采捕于中国南海，经碎冰低温保藏运送至海南省陵水县新村渔港。选取100 kg保存完好的鸢乌贼通过泡沫箱运回三亚热带水产研究院，运输全程保持低温状态。随机抽取鸢乌贼30条，测量其生物学指标，鸢乌贼胴长(14.2±4.7) cm，体质量(113.5±35.8) g。

1.1.2 方斑东风螺

适口性试验用方斑东风螺取自国家贝类产业技术体系三亚综合试验站示范基地，为健康且活力较强的2月龄个体，体质量(0.53±0.14) g，壳高(11.09±1.84) mm。

暂养于三亚热带水产研究院室外遮阳陆基玻璃钢池(直径2.0 m，高1.2 m的圆筒形)，养殖箱是40.0 cm×60.0 cm×18.0 cm的塑料框，内衬筛绢网，底部铺粒径0.5～2.0 mm的细沙5 cm，上方覆盖一层防逃网。试验所需的同规格养殖箱均置于同一个养殖池中，塑料筐上沿周边均固定泡沫，以保持半潜浮状态。养殖池24 h气石充氧，加过滤海水，换水量为100%/天，盐度29～32‰，水温28～30 ℃，pH 8.0～8.2，氨氮≤0.2 mg/L，亚硝酸盐≤0.02 mg/L。

1.1.3 仪器

臭氧发生器：广州中航环保科技有限公司ZH-OA20型；电子天平：双杰JJ124BC型电子天平；培养箱：广东泰宏君LRH-100A生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 鸢乌贼的预处理

随机挑选5只鸢乌贼，每只采样3次，使用平板稀释涂布法测定其基础带菌值，取所有结果的平均值为参照值(对照值)(其他测量细菌采样方法同此)。鸢乌贼的减菌预处理方式如下，连续5 d：

a. 对照组，采用参照值。

b. H2O2溶液处理：浸泡30 min。医用H2O2溶液(含量3%)(实验时纯净水稀释，体积比1∶4)。

c. 酒精处理：75%酒精浸泡30 min；95%酒精浸泡30 min。

d. 臭氧处理：通过臭氧发生器产生臭氧(流量300 mg/min)。用泡沫箱盛装煮沸后冷却的超纯水，臭氧输出管固定在底部，放入塑料筐。把鸢乌贼放入塑料框中，打开臭氧发生器并计时，在10 min、20 min、30 min、1 h、2 h时采集样品。该试验在通风橱中操作。

e. 紫外线处理：防水紫外灯处理，防水紫外线灯管为20 W。用泡沫箱盛装煮沸后冷却的超纯水，防水紫外灯固定在底部，放入塑料筐。把鸢乌贼放入塑料框中，四周用黑布包裹，开启紫外灯并计时，在10 min、20 min、30 min、1 h、2 h时采集样品。

1.2.2 减菌化试验细菌测定及减菌率

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中提供的方法进行测定。

减菌率定义为：使用减菌处理样品后所能杀死的细菌量占减菌处理前细菌总数的比例。计算公式为:

(1)

1.2.3 方斑东风螺适口性试验

以冷藏鸢乌贼作为对照组，H2O2溶液、酒精、臭氧、紫外线作为试验组，每组3个平行，每个平行投放方斑东风螺240 ind(密度1 000 ind/m2)。试验开始前，先做预试验，把鸢乌贼切块、投喂，确定投喂一个试验框1次所需的鸢乌贼质量，并以此为参考标准。每天8∶00和18∶00各投喂1次，2 h后收集残饵，沥干水，称重，记录，持续5 d。如果试验期间发现方斑东风螺死亡，应补充。摄食率定义为：方斑东风螺摄食的鸢乌贼重量与初始投饵量的比值，计算公式如下：

式(2)

1.3 数据分析

所有试验均重复3次，取其平均值，应用SPSS18.0 软件和Excel 软件进行数据的统计分析，组内显著性分析采用Duncan’s 比较，单因素差异分析，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 减菌处理对样品细菌含量的影响

不同减菌处理方式对南海鸢乌贼异养菌及大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)含量的影响如表1。对照组不做任何处理，其异养菌和大肠埃希氏菌含量分别达到(2.39×105±0.29×105)cfu/g、(1.00×104±0.62×103)cfu/g。利用不同减菌处理方式，鸢乌贼样品中的异养细菌和大肠埃希氏菌含量均显著减少(P<0.05)，但减少程度各不相同。异养菌除菌效果较好的有：H2O2溶液组、95%酒精组、臭氧20 min组、臭氧30 min组、臭氧1 h组、臭氧2 h组，减菌率达80%以上。大肠埃希氏菌除菌结果显示，臭氧1 h组和臭氧2 h组的除菌率最高，均为100%，而紫外10 min组最低，除菌率为36.67%。大肠杆菌除菌率达到90%以上的试验组有：H2O2溶液组、75%酒精组、95%酒精组、臭氧10 min组、臭氧20 min组、臭氧30 min组、臭氧1 h组、臭氧2 h组。

表1 不同减菌处理方式对鸢乌贼异养菌和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)含量及投喂效果Tab.1 Effects of different sterilization treatments on heterotrophic bacteria and Escherichia coli in Sthenoteuthis oualaniensis and feeding rate of Babylonia areolata

2.2 减菌处理对样品适口性的影响

减菌处理后的南海鸢乌贼作为替代蛋白源对方斑东风螺摄食率的影响如表1所示。冷藏鸢乌贼(对照组)对应方斑东风螺的摄食率为(65.19±2.77)%，而试验组的摄食率在45.59%～67.70%之间，最高的紫外20 min组为67.70%。通过与对照组进行比较发现，H2O2溶液组、75%酒精组、95%酒精组、臭氧30 min组、臭氧1 h组、臭氧2 h组等试验组的摄食率显著低于对照组(P<0.05)，说明相关减菌化处理方式对南海鸢乌贼的适口性产生了较大的影响。紫外线、臭氧10 min、臭氧20 min组的摄食率与对照组差异不显著(P>0.05)。

综合减菌率和适口性试验结果表明，使用臭氧对鸢乌贼进行减菌化处理，以约20 min为宜，不仅可以除去鸢乌贼中大量细菌，保持其原有的风味，而且不会影响方斑东风螺的摄食率。

3 讨论

3.1 减菌处理对样品细菌含量的影响

H2O2溶液氧化能力极强，可利用活性氧破坏微生物体内的原生质，从而达到杀灭微生物的目的[8]。另有报道，H2O2原液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)杀灭率为 99.99%[9-10]，优于本研究对大肠埃希氏菌的减菌率91.76%，这可能与试验环境和H2O2溶液浓度有关。酒精可改变病原体蛋白质的空间结构，使蛋白质发生不可逆的变性、凝固，丧失活性，从而杀死病原体。本研究中，酒精处理减菌率78%～81%，只要酒精的浓度介于70%～78%都可以达到杀菌99%的效果[11]。本研究酒精减菌率较低可能与操作有关。紫外线杀菌技术以其安全、高效、广谱的特点，广泛用于食品工业的减菌[12]。其中紫外线对异养细菌减菌率为53.07%～77.90%，对大肠埃希氏菌减菌率36.67%～79.32%，显著低于刘骁等[13]报道的紫外线对细菌总数和大肠菌群的杀菌率为(99.99±1.20)%和(99.99±1.43)%。紫外线灭菌效果受紫外灯管长度、水的透射率、照射时间等的影响，而本试验环境和李同等[14]的试验环境不同，导致减菌率偏低。臭氧是一种水溶性气体，是强氧化剂。其可通过攻击和氧化细胞壁和细胞膜来破坏微生物，达到杀菌目的[15]。臭氧在水中不断发生还原反应所产生的单原子氧[O]和羟基均具有极强的氧化能力和破坏病原体细胞膜并渗透到细胞膜内杀死病原体的能力, 可实现良好的减菌效果[16]。孙继英等[17]用流动臭氧水处理军曹鱼(Rachycentroncanadum)肉片，减菌率为81.12%；安玥琦等[18]用浓度为7.8 mg/L 臭氧水淋洗处理鳙(Aristichthysnobilis)的头部5 min, 其减菌率可高达90.43%。本研究结果显示臭氧对异养细菌减菌率82.98%以上，对大肠埃希氏菌减菌率95.92%以上，随作用时间延长，减菌率增加与以上研究结果相似。郭姗姗等[19]、余海霞等[20]、Rowe等[21]分别研究了臭氧水减菌处理对淡水鱼、海水鱼等品质的影响, 所用较低浓度的臭氧水均为臭氧发生器直接充气法制备的。但是郝淑贤等[22]提出低浓度臭氧水对水产品本身或内部潜藏的菌体杀菌效果较弱，必须达到一定浓度, 否则难以保证杀菌效果。本研究中，试验时间长，减菌率高，这与臭氧浓度增加有关。

3.2 减菌处理对样品适口性的影响

台湾方斑东风螺的嗅觉发达，饵料投入约 2～3 s后，部分个体朝着食物方向爬行觅食。在流水状态下，其嗅觉可达 680～820 cm；在静水状态下, 嗅觉达 100 cm左右，对不同的食物，嗅觉反应存在差异[23]。H2O2氧化能力极强，预处理后的鸢乌贼体表因氧化作用而呈白色，可被检测到的腥味物质含量降低，蛋白适度氧化并伴随着二级结构改变[24]。当鸢乌贼被H2O2溶液预处理后，导致其诱食效果下降，方斑东风螺的摄食率显著低于对照组。鸢乌贼的蛋白质含量较高，酒精可使蛋白质变性，破坏其风味。酒精具有一定的渗透性，可残留于鸢乌贼体内，影响其诱食效果，从而导致方斑东风螺摄食率显著低于对照组。另外使用酒精成本较高，高浓度酒精易燃，不宜作为常规消毒方法使用。紫外线作用于微生物DNA，通过阻碍细胞的正常功能而达到杀菌的效果[25]，并且一般不会在物体上留下明显的物理损害和化学残留物。本研究结果显示各紫外线试验组预处理后的鸢乌贼诱食效果与对照组差异不显著，且过长时间(紫外线1 h、紫外线2 h)预处理后，方斑东风螺摄食率低于对照组，但差异不显著；不同时间处理组之间摄食率差异也不显著。如果紫外灯光照射时间过长，可能会导致蛋白氧化而影响诱食效果，降低摄食率[26]。本试验中紫外光预处理时间短的两组(10 min、20 min)，其方斑东风螺摄食率高于时间长的两组(1 h、2 h)也进一步证实了以上结论。臭氧极强的氧化能力，能脱色、除味，臭氧浓度越高，对鱼片色泽影响越大[27]，过长时间的臭氧处理可氧化鸢乌贼中的蛋白质，降低诱食效果，其机理有待进一步探讨[28]。

4 结论

综上，臭氧处理20 min后，异养菌去除率达91.2%，大肠埃希氏菌去除率达98.12%。而适口性方面，随着臭氧处理的时间延长，鸢乌贼的适口性有所下降，其中以臭氧处理10 min和20 min组效果较好。