鱼饵料中地西泮含量调查及其对水产品养殖影响分析

杨光昕，汤云瑜，程逸凡，张婧茹，张楷文，沈晓盛，张小刚，王军，孔聪*

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090; 2. 中国海洋大学, 海洋生命学院, 青岛 266003; 3. 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司, 上海 200335)

地西泮(Diazepam, DZP)，又名安定，是一种典型的苯二氮卓类镇定剂，具有镇定、催眠抗癫痫、抗惊厥、戒酒等作用[1-3]，在人类临床和兽医临床中使用广泛[4-5]。长期服用DZP会产生一系列副作用，如易怒、嗜睡、幻听、头痛、乏力，甚至产生药物依赖性和耐药性[6-8]。而且，DZP在动物体内残留后可通过食物链进入人体，威胁人体健康[9-10]。在水产养殖行业中，中国禁止在水产养殖过程中使用DZP，《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)中规定DZP不得在动物性食品中检出。但近年来水产品中DZP残留检出事件在国内多个省份中频有发生[11]。在《农业农村部关于监督抽查发现的27批次问题农产品情况的通告》(农业农村部〔2022〕3号)中[12]，有18批次问题样品属于水产品，其中在16批次问题水产样品中检出DZP残留，涉及鲤(Cyprinuscarpio)、鳊(Parabramispekinensis)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲫(Carassiusauratus)等品种，问题样品分布在5个省份的7个地区。前期工作对大批量水产品进行筛查，发现DZP在鲫、草鱼等水产品中的检出率较高[13]。曾军杰等[14]在鱼类药物残留大排查中发现多例水产品中含有DZP。这些报道表明目前水产品中DZP残留问题较为突出，严重影响了水产品养殖业的发展，同时给消费者的身体健康带来了潜在的威胁。因此，在关注水产品中DZP残留量的同时，更要分析DZP的污染源，从源头控制违禁药物的使用。

虽然DZP在水产品中屡有检出[15-16]，也引起了市场监管部门和学者们的关注，但现有研究多集中于DZP检测方法的构建和样品筛查，对于水产品中DZP的来源分析相对较少。有学者认为生产经营者在运输环节可能会非法使用DZP来提高水产品成活率[17-18]，然而实验室在样品筛查中发现市售水产品中DZP的残留量较低[13]，且在养殖产地采集的水产品样品中也发现了DZP残留，这表明运输过程中非法使用并不是水产品中DZP的唯一来源。

环境水体污染是造成水生生物中污染物残留的主要因素之一[19]，由于DZP在人体或动物内的不完全代谢、药物滥用等原因，该药物可通过养殖废水、生活及医疗废水等途径进入自然水体，造成环境污染[20-23]。目前在世界大多数国家和地区的自然水体中均有DZP检出[24-25]。Zhang等[26]调查了2017—2019年厦门市主要河流中新型污染物的分布特征，结果发现DZP在这3年的检出率分别为89.00%、46.00%和90.00%，检出浓度为0.00～5.39 ng/L。水产品养殖用水大多来源于地表水，这也使得水产品养殖过程中可能受到环境DZP残留的影响。刘洋峰等[27]对水产养殖池塘水体进行DZP残留量筛查，结果发现DZP的检出率为63.30%，其含量主要集中在10.00 ng/L，然而在受污染鱼塘采集的生物样品中并未检出DZP，提示低浓度暴露水平下DZP可能不会在鱼体内富集[28]。

投入品是影响水产品质量安全的重要因素，也是污染物进入水产品中的重要途径。然而本研究在前期对渔用饲料及渔药等投入品的筛查中并未发现DZP及其相关药物。目前，尚未有关于渔用饲料及渔药中有检出DZP的报道。因此，水产品中的DZP残留可能源自其他途径。

有研究发现斑马鱼(Brachydanioreriovar)在16.00 μg/L和160.00 μg/L的水环境浓度中会发生群聚效应，且更倾向于停留在DZP药物所在的区域[29]。这一结果表明投放含有DZP的饵料可能更容易捕获目标物。基于这一推断，分析前期筛查中发现的阳性水产品样品及其来源，发现阳性样品的检出种类大多为鲫、草鱼、鳊、鲤等淡水养殖品种，其产地登记来源场所大多具备休闲垂钓功能，而垂钓过程中会消耗大量的饵料。因而，我们设想生产经营者可能为了提高垂钓者的捕鱼成功率，在饵料中掺杂DZP，或者饵料生产商为了提高饵料效果，在生产过程中掺杂DZP，以获取较高的收益，这些含有DZP的饵料可能成为水产品中DZP的主要来源。为了验证这一设想，我们在市场上随机购买了35份垂钓所用的饵料，采用高效液相色谱串联质谱法来筛查饵料中的DZP及其主要降解产物奥沙西泮(Oxazepam)、去甲地西泮(Nordiazepam)、替马西泮(Temazepam)的含量，分析其与水产品中DZP残留来源的关联性，并进一步评估其对水产品质量安全的影响，为监管部门提供有效的参考和技术支撑。

1 材料与方法

1.1仪器与材料

液相色谱串联三重四极杆质谱仪(液相：岛津LC20AD，质谱：AB Sciex Qtrap 5500)，配备电喷雾离子源。DZP、奥沙西泮、去甲地西泮、替马西泮标准溶液和地西泮-D5(1.000±0.005 mg/mL，美国Cerilliant公司)；乙腈、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯，美国Baker公司)；甲酸(分析纯，美国sigma公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(40～63 μm，60 Å，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；十八烷基硅烷分散固相萃取材料(C18)(40～60 μm，60 Å，上海普誉科贸有限公司)；PTFE滤膜(0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司)。

1.2 样品采集与制备

以网购的形式随机购买不同厂家生产的饵料，共计35个，样品收到时均包装完好。如表1所示，这些饵料样品适用于淡水鱼类[鲫、鲤、草鱼、鲈(Lateolabraxjaponicus)、罗非鱼(Oreochromismossambicus)等]，其产地分布在国内9个省市的23个地区，形态特征主要有膏状、干粉、湿粉、块状、糊状和悬浊液，主要成分包括谷物类、动物组织、鱼虾粉和藻类等，但一些产品主要成分表述不清，给监管部门和消费者选购带来了不便。

表1 鱼饵料样品信息Tab.1 The information of fish bait samples

续表1,Tab.1 Continued

颗粒状和块状的饵料样品研磨成粉状待用，其他样品直接分装、称量后待测。

1.3 样品前处理

前处理方法在前期工作[30]的基础上，预先加入2 mL水，使饵料充分分散，在样品萃取混合液中加入1 g NaCl，以达到有机相萃取剂和水相充分分离的效果。其他步骤与文献中一致。具体方法为：准确称取2 g 样品于50 mL 具塞离心管中，加入 60 μL内标溶液，充分混合后加入2 mL水，旋涡1 min，再加入5 mL乙酸乙酯，旋涡混合10 min后加入1 g NaCl，继续旋涡 3 min，然后在4 ℃下以 4 000 r/min离心10 min，取上层提取液于玻璃管中。在剩余残渣中加入5 mL乙酸乙酯重复提取一次(不重复加入NaCl)，合并乙酸乙酯提取液，氮气吹干(或仅剩油脂)。加入1 mL 乙腈∶水(8∶2,v/v)溶液充分旋涡溶解残留物。在复溶液中加入50 mg PSA和50 mg C18，旋涡混合10 min，静置 5 min后过 0.22 μm PTFE滤膜待测。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution HD 色谱柱(3.0 mm×150.0 mm，1.8 μm);流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相A为 5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸)，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为：0.00～1.50 min，1% B；1.50～4.00 min，1%～90% B；4.00～6.00 min，95～99% B；6.00～6.15 min，95～99% B；6.15～8.50，99% B；8.50～8.65 min，99～1% B；8.65～10.00 min，1% B。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气：40 psi；喷雾气55 psi、辅助加热气：55 psi；碰撞气：medium；质谱参数见表2。

表2 DZP及其降解产物和同位素内标化合物的多重反应监测参数Tab.2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for detection of DZP, its degradation products and isotope internal standard

2 结果与分析

2.1 方法建立及有效性评价

通过基质加标的方式对建立的方法进行性能评价。首先在空白饵料中进行低浓度水平加标，通过检查信噪比，确定该方法DZP、奥沙西泮、去甲地西泮、替马西泮的最低检出限均为0.5 μg/kg(S/N>3)，定量限均为1.0 μg/kg(S/N>10)。

在空白饵料样品中添加已知浓度的DZP及其降解产物混合工作液，加标浓度为1 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg，每个浓度重复6次。结果显示，在1～10 μg/kg添加浓度范围内，4种物质在饵料中的回收率为77.6%～117.9%，批内和批间变异系数不大于8.4%。这表明该方法具有较好的准确度和精密度，可以用来检测鱼饵料中DZP及其降解产物的残留量。

2.2 样品筛查结果

对35个鱼饵料样品进行分析检测，结果如表3所示，共有14个样品检测出DZP，检出率为40.00%，其残留量为1.25～82 214.00 μg/kg，典型阳性样品中DZP的提取离子流色谱图如图1A所示。在检出的饵料样品中，有25.71%的样品中DZP残留量低于10 μg/kg，有2.86%的样品中DZP残留量在10～100 μg/kg，有11.43%的样品中DZP残留量在100 μg/kg以上。其中3号样品、15号样品、28号样品和29号样品中的DZP残留量分别高达82 214 μg/kg、35 414 μg/kg、31 758 μg/kg和12 790 μg/kg。

DZP的主要降解产物去甲地西泮、替马西泮和奥沙西泮在样品中的检出率相对较低，去甲地西泮和替马西泮仅在4个DZP残留量高的样品中检出，检出率均为11.43%，残留量分别为50.41～2 055.00 μg/kg和30.42～968.00 μg/kg，典型阳性样品中DZP降解产物的提取离子流色谱图如图1B～D所示。而奥沙西泮仅在DZP残留量最高的3号样品中检出，检出率为2.86%，残留量为4.93 μg/kg。

图1 典型阳性样品中DZP(A)及其降解产物去甲地西泮(B)、替马西泮(C)、奥沙西泮(D)的提取离子流色谱图Fig.1 XIC chromatograms of DZP (A) and its degradation products (B: Nordiazepam, C: Temazepam and D: Oxazepam) in a representative positive sample

2.3 样品中DZP来源分析

DZP在鱼饵料样品中的检出率较高，部分样品中的残留量非常大，而其主要降解产物仅在DZP残留量最高的4个样品中检出，且浓度占比较低，其含量总和低于DZP含量的4.8%，其中去甲地西泮和替马西泮的浓度与DZP的浓度比分别为0.39%～2.50%和0.24%～2.54%，奥沙西泮仅在DZP残留量最高的样品3中检出，含量仅为4.93 μg/kg，与地西泮的浓度比极低。李明等[31]通过灌胃对大鼠暴露DZP，2 h 后肌肉中去甲地西泮与DZP的浓度比为14.17%。何文婷等[32]用DZP对家兔染毒，8 h肌肉中去甲地西泮与DZP的浓度比为36.70%，且随着时间的增加，去甲地西泮的含量远超过DZP的含量。这说明DZP在生物体内经短时间暴露后，其代谢物占比即达到较高的水平。表明饵料中的DZP降解产物可能源自DZP产品本身所含杂质，而不是经生物体代谢所产生。同时也说明以上4份饵料中的DZP非生产原料中代谢残留所致，极有可能是人为添加。不仅如此，考虑到购买饵料的成本以及人用DZP药物的价格，生产者使用人用药物直接添加到饵料中将极大增加其生产成本，人用药流入饵料生产链条的可能性较低。这些结果也说明饵料生产加工过程中可能存在非法获取DZP原料药的途径。

表3 样品中DZP及其降解产物的含量检测结果Tab.3 The contents of DZP and its degradation products in the fish bait samples

续表3,Tab.3 Continued

2.4 鱼饵料中DZP的添加意图分析

结合近年来水产品中DZP频繁检出，且阳性样品多为鲫、草鱼、鲤等与休闲渔业相关品种和来源的报道[12-13]，可以表明饵料中的DZP可能是水产品中DZP残留的主要来源之一，但饵料中添加DZP的意图尚不明确。有研究发现斑马鱼暴露在受DZP污染的水域中会产生集群效应，且更倾向于停留在受DZP污染的区域[29]，甚至增加进食率[33]。添加高浓度的DZP可能是为了提高饵料在垂钓中的捕鱼效果。将含DZP的饵料抛洒在水中会在短时间内形成一个含有高浓度DZP的空间环境，促使周边的鱼在这里聚集和进食，从而达到快速捕鱼的效果。高效的饵料意味着高销量，进而获取高额的利益，这可能是生产经营者在饵料中非法添加DZP的主要原因。

目前有很多水产养殖场所具备休闲垂钓功能，鱼饵料使用量较大，在水体中抛洒含DZP的饵料，会造成大面积水体污染，进而导致相关水产养殖基地和品种存在较高的被动用药风险。DZP在环境中的代谢周期较长[34]，养殖鱼塘属于相对封闭的水体环境，残留在鱼塘中的DZP会长期存在于水体和底泥中，对水产养殖造成长期的影响。这可能是在水产品和水产养殖水体中频繁检出DZP的原因之一。此外，野外垂钓过程中使用掺杂DZP的饵料也会造成自然水体污染，给水生生物和生态环境带来潜在的威胁。

3 结论

DZP在水产品中频繁检出，但其污染源头尚不明确。本研究调查了渔用饵料中DZP及其降解产物的残留状况，发现DZP的检出率较高，残留量较大，最高可达82 214 μg/kg。经分析，饵料中的DZP极有可能是人为添加所致，且存在非法原药来源途径，其使用来源不受监控增加了药物在水产品中污染残留风险，这可能是造成养殖环境污染、水产品中频繁检出DZP的主要原因。

饵料是捕鱼过程中的重要投入品，然而目前关于饵料中违禁药品使用情况的研究相对较少。本研究认为针对DZP在水产品和养殖环境中的残留现状应进行以下应对措施：一是对饵料中DZP的原材料来源进行调查；二是理清使用DZP的原因，寻找合法安全替代方案；三是研究暴露后在水产品的代谢与消除规律；四是调查环境中DZP的分布特征以及评估DZP对水产品、生态环境和人体健康的长期影响。