春桑叶和霜桑叶次生代谢成分含量的比较研究

姚正颖，侯北伟，钱 月，金敬红，林群英，胡卫成，范晶玉，孙力军*

（1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211000；2.淮阴师范学院，江苏 淮安 223300；3.南京普康和瑞生物科技有限公司，江苏 南京 211106）

桑（Morus albaL.）为桑科桑属植物［1］。桑叶是我国药食同源目录原料，具有很高的药用及食用价值。研究表明，桑叶含多糖、1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）、黄 酮、γ-氨 基 丁 酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）等多种次生代谢组分，具有抗癌、降血脂、降血糖以及降血压等生理活性［3-5］。我国桑叶资源十分丰富，桑园面积达9.5×105hm2，种桑养蚕农户约2×107户，桑叶年产超1.5×107t［6］。不同季节采收的桑叶有着不同用途，春、夏、秋季采收用以饲蚕和食品加工，霜降之后采收桑叶用以入药。桑叶虽然高产，但存在产量过剩、利用率较低的问题，造成了一定的资源浪费。现有研究主要以桑叶的完整叶片为研究对象，对其活性成分进行检测分析，而对桑叶叶肉部分和叶脉部分中活性物质分布情况的研究报道较少。此外，蚕养殖过程中产生的桑叶剩余物主要为叶脉部分，这部分废弃物资源的利用价值值得深入探讨。

因此，本研究对春桑叶和霜桑叶叶片和叶脉部位的主要次生代谢成分含量进行检测和比较研究，以期为桑叶资源的高效利用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜桑叶于2019年春季4月30日、秋季霜降后11月19日采摘自江苏省海安市桑园。DNJ对照品（HPLC＞98%），国药集团化学试剂有限公司；GABA，BBI Life Scicences；芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）、β-谷甾醇，上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯），Sigma-Aldrich；其它试剂均为国产分析纯。

紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；高速台式离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶水提取物制备

桑叶于65℃干燥至恒重，模彷蚕食效果，将桑叶分为蚕食部分和以叶脉为主的剩余部分，粉碎后过60目筛。取粉末0.8 g，加入24 mL蒸馏水，在90℃下浸提2 h，抽滤，滤渣再用热水浸提一次，合并二次滤液，定容至50 mL，用于DNJ、多糖、黄酮的检测。

1.2.2 桑叶总糖的测定

采用硫酸-苯酚法测定桑叶总糖［7］。桑叶总糖标准曲线的制备：精密吸取0.1 mg/mL的标准葡萄糖储备液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于试管中，分别用蒸馏水补充至1 mL，得到葡萄糖的梯度稀释液。先在试管中加入8%苯酚溶液0.5 mL，再向各管加入浓硫酸2.5 mL，震荡混匀后沸水浴20 min，取出，冷水浴5 min，在490 nm波长下测吸光度，记录并处理相关数据。

桑叶总糖的测定：精密吸取桑叶水提物1 mL，加入8%苯酚溶液0.5 mL，再向各管加入浓硫酸2.5 mL，震荡混匀后，沸水加热20 min，取出，冷水浴5 min，在490 nm波长下测吸光度，并记录相关数据。

1.2.3 桑叶DNJ含量的测定

采用芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生-高效液相色谱法测定桑叶中DNJ的含量［8］。

DNJ标准溶液的配制：用甲醇作为溶剂，先配制成1 mg/mL的标准溶液，再稀释成1、2.5、5、7.5、10μg/mL的标准溶液。

DNJ的衍生化：分别吸取500μL DNJ标准液和桑叶水提液于离心管中，加入50μL硼酸钾缓冲液（0.4 mol/L，pH 8.5），再 加 入100μL FMOC-Cl（5 mmol/L，溶于乙腈），混匀后，在20℃的恒温水浴锅中反应20 min，再加入50μL甘氨酸溶液（0.1 mol/L），让剩余的衍生化试剂发生反应，最后加入4.3 mL乙酸溶液（10%），混匀后，用0.45μm滤膜过滤，待测。

液相色谱测定条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；流动相为乙腈和0.1%乙酸水溶液（1∶1，v/v），流速1 mL/min，柱温25℃，紫外检测波长254 nm；进样量20μL。

1.2.4 桑叶GABA含量的测定

采用FMOC-Cl柱前衍生-高效液相色谱法测定桑叶中GABA的含量［8］。

GABA标准溶液的配制：先配制成1 mg/mL的GABA标准溶液，再稀释成1、5、10、20、40μg/mL的GABA标准溶液。

GABA的衍生化：分别吸取400μL GABA标准液和桑叶水提液于离心管中，加入100μL硼酸钾缓冲液（0.5 mol/L，pH 8.5），再加入500μL FMOC-Cl（3 mmol/L，溶于乙腈），混匀后，在室温放置10 min，再加入50μL甘氨酸溶液（0.1 mol/L），让剩余的衍生化试剂发生反应，最后加入100μL乙酸溶液（10%），混匀后，用0.45μm滤膜过滤，待测。

液相色谱测定条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；以乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 5.8，含0.05%三乙胺）为流动相A，80%的乙腈溶液为流动相B，按表1程序梯度洗脱；柱温40℃，流速为0.5 mL/min；紫外检测波长254 nm；进样量20μL。

表1 HPLC检测GABA梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC for GABA detection

1.2.5 桑叶总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定桑叶黄酮，根据芦丁标准工作曲线求出桑叶总黄酮含量（以芦丁计）［7］。

1.2.6 桑叶甾醇含量的测定

取桑叶粉末5 g，用滤纸包好放入索氏提取器，加入20 mL的氯仿，于80℃加热回流至浸提液颜色为无色，用旋转蒸发仪回收氯仿至干燥。加入甲醇溶解提取物，定容至50 mL［9］。

采用HPLC-ELSD法测定桑叶甾醇的含量［9］。

β-谷甾醇标准溶液的配制：以甲醇为溶剂，配制0.25 mg/mL的β-谷甾醇标准溶液，再稀释成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的β-谷甾醇标准溶液，0.45μm滤膜过滤后，待测。

液相色谱测定条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；进样量20μL；流动相为甲醇；流速为0.8 mL/min；柱温25℃；ELSD漂移管温度为60℃。

1.3 数据处理

采用SPSS 19软件对数据进行处理分析，采用Excel 2010软件作图。

3 结果与分析

3.1 桑叶总糖含量的测定结果

根据葡萄糖含量标准曲线（Y=12.292X+0.014 4，R2=0.999 4），检测出春桑叶和霜桑叶及其叶脉的总糖含量。如图1所示，桑叶总糖含量均高于桑叶脉，霜桑叶中叶片总糖含量是叶脉的1.98倍，春桑叶中叶片总糖是叶脉的1.96倍，可见桑叶叶片部分是总糖富集部位。霜桑叶、霜桑叶脉总糖含量均高于春桑叶、春桑叶脉，霜桑叶中叶片总糖的含量最高，为362.7 mg/g，其次为霜桑叶脉，含量为183.6 mg/g。生长季节对于桑叶活性成分的影响关系密切，中国药典以霜桑叶入药，表明桑叶经霜后产生的活性物质具有最佳药效。本研究数据显示，经霜桑叶中的总糖成分含量显著升高，可见总糖尤其是多糖是霜桑叶发挥药效的重要活性成分［7］。

图1 桑叶样品的总糖含量Fig.1 The contents of total sugars from mulberry leaves

3.2 桑叶中DNJ含量的测定结果

采用柱前衍生化-HPLC测定桑叶DNJ含量，根据DNJ标准曲线（Y=3.283 2X-0.519 5，R2=0.9984）测得春桑叶和霜桑叶的不同部位的DNJ含量。由图2可知，桑叶叶脉部位的DNJ含量高于叶片中DNJ含量，春桑叶脉的DNJ含量是春桑叶的1.3倍，霜桑叶脉的DNJ含量是霜桑叶的1.26倍。春桑叶的DNJ含量高于霜桑叶，其中叶脉部分的DNJ含量最高，为230.7μg/g，是霜桑叶叶脉的2.1倍。由此可见，经霜后，桑叶中DNJ的含量显著降低。说明较高温度，有利于DNJ的合成与积累［10-11］。春桑叶饲蚕后的剩余物中保留较高的DNJ成分，这部分的废弃物资源可进一步利用开发。

图2 桑叶样品的DNJ含量图Fig.2 The contents of DNJ from mulberry leaves

3.3 桑叶中GABA的含量的测定结果

采用柱前衍生化-HPLC测定桑叶GABA含量，根 据GABA标 准 曲 线（Y=130.88X+24.217，R2=0.999 4）测得春桑叶和霜桑叶不同部位的GABA含量。由图3可知，春桑叶叶片中的GABA含量值最高，达415.7μg/g，是春桑叶脉的1.86倍，霜桑叶片的3.58倍。桑叶GABA含量与生长季节有关，经霜后，桑叶GABA含量下降显著［9］。春桑叶叶脉部分保留较高的GABA，含量为223.8μg/g，在蚕饲剩余物中具有很大的开发价值。

图3 桑叶样品GABA含量Fig.3 The contents of GABA from mulberry leaves

3.4 桑叶中黄酮含量的测定结果

根据芦丁标准曲线（Y=12.162+0.013 5，R2=0.999 7）测得春桑叶和霜桑叶及其叶脉的黄酮含量。由图4可知桑叶中叶片部位的黄酮含量高于叶脉，春桑叶中叶片的黄酮含量是春桑叶叶脉的含量2.3倍左右；霜桑叶中叶片的黄酮含量是霜桑叶叶脉的含量的2.5倍左右。经霜后，黄酮含量在叶片中进一步富集，霜桑叶叶片部位的黄酮含量最高，为2.33 mg/g。可见，温度降低有利于桑叶中黄酮物质的合成与积累，是桑叶经霜后发挥药效的重要原因［10，12-13］。

图4 桑叶样品黄酮的含量图Fig.4 The contents of flavonoids from mulberry leaves

3.5 桑叶甾醇含量的测定结果

根据β-谷甾醇标准曲线（Y=10 383X-213.21，R2=0.999 5）检测出桑叶β-谷甾醇的含量。由图5可知，春桑叶叶片中甾醇的含量与春桑叶脉的含量相当。经霜后，桑叶甾醇含量有显著提升，霜桑叶中叶片的甾醇含量最高，达1.62 mg/g，是霜桑叶叶脉的1.2倍，是春桑叶叶片的1.4倍。研究表明，β-谷甾醇具有降糖降脂、增强免疫力等功效［14］。网络药理学分析指出β-谷甾醇是桑叶降糖作用的关键药效成分［15］。本研究结果可知，经霜后的桑叶中β-谷甾醇不断积累，有助于霜桑叶发挥药效。

图5 桑叶β-谷甾醇含量图Fig.5 The contents ofβ-sitosterols from mulberry leaves

4 讨论与结论

本研究分别针对春桑叶和霜桑叶叶片和叶脉部位的主要次生代谢成分含量进行检测和比较研究，尤其关注了春桑叶叶脉中的成分变化。结果表明，不同季节采摘的桑叶次生代谢成分含量受环境温度影响明显。从表2可见，霜桑叶中总糖、黄酮和β-谷甾醇的含量均显著高于春桑叶，且叶片部分高于叶脉部分。说明经霜过程有助于活性药效成分的产生和积累，亦佐证了总糖、黄酮或β-谷甾醇可能在霜桑叶发挥疏散风热、清肺润燥、清肝明目等药效中起其重要作用［10］。

表2 春桑叶和霜桑叶次生代谢成分含量Tab.2 The contents of secondary metabolites from spring mulberry leaves and frost mulberry leaves

DNJ是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖等生物活性［16］。桑叶是天然DNJ的主要来源，其含量受到桑树品种、产地、采摘时期、部位等因素的影响［17］。李名杰等研究发现，随着气温降低，桑叶DNJ含量急剧下降，在11月份左右，不同地域的桑叶DNJ含量都下降至0.1%以下［18］。夏文银等测得霜桑绿茶的DNJ含量明显低于春桑茶［19］。本研究与上述研究结论一致，霜桑叶DNJ含量显著低于春桑叶。GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，具有镇静神经、抗焦虑及降血压等多种药理作用［20］。不同生长季节桑叶中GABA的含量有所不同，仝义超研究指出，7月后GABA的含量逐渐降低［9］。本研究中霜桑叶的GABA含量亦明显低于春桑叶。

春桑叶是家蚕的主要饲料，蚕养殖过程中产生大量的桑叶剩余物，主要是桑叶的叶脉部分。本研究对春桑叶叶脉的活性成分检测分析结果表明，该部分保留了较高的DNJ、GABA和β-谷甾醇，尤其是DNJ含量显著高于叶片部分。因此，饲蚕后的桑叶剩余物在降糖降压保健食品开发方面具有较好的开发潜力，可以及时收集、消杀和干燥，变废为宝，提高桑叶资源利用率。