反复种植失败患者的外周血Th17/调节性T淋巴细胞的失衡情况▲

黄千贻 江 莉 李柳铭 吴惠梅 李慕军

(广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心，广西南宁市 530021)

近年来，考虑到体外受精技术的进步及每个周期移植胚胎数量的减少，越来越多的生殖学家建议将反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)定义为不孕患者连续两次体外受精周期(包括冻融胚胎移植周期)累积移植卵裂期优质胚胎个数≥4个或优质囊胚个数≥2个，而未获得临床妊娠[1-2]。胚胎植入及胎盘形成过程受一系列细胞因子、核转录因子和分泌蛋白的调控，这些因子或蛋白表达失衡或功能异常均可导致胚胎移植失败。母胎界面的免疫调节对妊娠结局起重要作用。一直以来，学者们主要关注母胎界面Th1/Th2平衡的相关研究。近年来，越来越多研究表明，Th17和调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte,Treg)分别作为效应性细胞和调节性细胞参与妊娠的建立和维持[3-4]。二者之间的免疫平衡是维持免疫环境稳定的必需条件，一旦失衡可能导致妊娠失败及某些不良妊娠疾病的发生，如不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)、早产、RIF等[5-7]。本研究拟通过检测Treg、Th17及相关因子在RIF患者外周血中的表达情况，探讨Th17及Treg与RIF发病的相关性，为寻找RIF的有效临床治疗靶点提供证据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月1日至9月30日因“输卵管因素(除输卵管明显积水外)”在我院生殖医学研究中心行胚胎移植的26例RIF患者作为RIF组，年龄(30.88±2.64)岁。纳入标准：既往2次及2次以上胚胎移植失败，每次移植至少有1枚优质胚胎(优质胚胎标准为卵裂期胚胎分级按数量和等级分类，优质胚胎为6个或6个以上细胞，碎裂率<10%，没有多核)，宫腔镜检查无异常，内分泌功能正常。排除标准：(1)卵巢储备功能差，即年龄>38岁，或获卵数≤3枚，或基础卵泡刺激素≥20 IU/mL者；(2)有活动性疾病，包括自身免疫性疾病等；(3)宫腔形态异常者；(4)输卵管明显积水者；(5)胚胎移植前B超提示子宫内膜厚度<7 mm者；(6)染色体异常者；(7)多囊卵巢综合征者；(8)子宫内膜异位症者；(9)抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗卵巢抗体阳性者，自然杀伤细胞数量异常者；(10)男方存在不孕因素者。纳入27例非妊娠期且生育功能正常的女性作为对照组，年龄(30.43±3.58)岁。纳入标准：年龄<38岁，至少1次成功妊娠，月经周期规则(21～35 d)。排除标准：有不孕史或妊娠流产史者。所有研究对象均了解研究方案并签署知情同意书。两组患者的年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已通过广西医科大学第一附属医院医学伦理委员会的审查。

1.2 主要试剂与设备 Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液(批号：17-1440-03)购自美国GE公司，多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物 (peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)-CyTM5.5小鼠抗人CD4单克隆抗体(批号：560650)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的小鼠抗人CD25单克隆抗体(批号：557138)、Alexa Fluor®647小鼠抗人叉头状/翅膀状螺旋转录因子P3(forkhead/winged-helix transcription factor P3,FOXP3)单克隆抗体(批号：560045)、PE标记的小鼠抗人白细胞介素(interleukin,IL)-17A单克隆抗体(批号：560436)、相匹配的同型对照抗体PE Mouse IgG1κ(批号：556650)、蛋白转移抑制剂(含莫能霉素，批号：554724)均购自美国BD Pharmingen公司，离子霉素(批号：9995s)购自美国Cell Signaling Technology公司，佛波酯(批号：P8139)购自美国Sigma-Aldrich公司，反转录试剂盒(批号：PRR047A)购自大连宝生物工程有限公司、荧光定量PCR试剂盒(mix)(批号：4913914001)购自美国Roche公司， 转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1；批号：CSB-E04725h)、IL-10(批号：CSB-E04593h)、 IL-6(批号：CSB-E04638h)、IL-17A(批号：CSB-E12819h)和IL-23(批号：CSB-E08461h) ELISA试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司，TAE缓冲液(批号：N10053)购自上海双螺旋生物科技有限公司，TRIzol试剂(批号：15596-026)购自赛默飞世尔科技公司。Facscanto Ⅱ型流式细胞仪购自美国BD Pharmingen公司，MX3000型实时荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司，Model-450型酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 外周血单核淋巴细胞的提取：采集两组研究对象处于月经周期增殖晚期时的外周血约3 mL，装于抗凝管内(含肝素0.1 mL)，根据试剂说明书的相关步骤，采用Ficoll-Hypaque不连续密度梯度离心法，分离出外周血单核淋巴细胞。

1.3.2 流式细胞术检测外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg比例：采用PBS重悬外周血单核淋巴细胞，在细胞悬液的样本管和对照管中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗体2 μL，随后在样本管中加入PE标记的小鼠抗人CD25抗体10 μL，同时在对照管中加入10 μL同型对照PE Mouse IgG1κ，室温避光孵育30 min。经PBS洗涤2次后弃上清，加入破膜液混匀，室温避光孵育30 min。洗涤弃上清，将Alexa Fluor®647小鼠抗人FOXP3抗体及同型对照抗体PE Mouse IgG1κ各20 μL分别加入到样本管和对照管中，室温避光孵育30 min。经PBS液洗涤2次后，加入2%多聚甲醛300 μL重悬，4 ℃冰箱避光保存，24 h内上流式仪检测，计算CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴细胞比值。

1.3.3 流式细胞术检测人外周血CD4+IL-17A+Th17：用RPMI-1640重悬外周血单核淋巴细胞后，依次加入离子霉素、佛波酯、蛋白转移抑制剂，于37 ℃、5% CO2培养箱孵育5 h。收集细胞装于干燥的流式管中， PBS洗涤2次。在100 μL的细胞悬液中加入PerCP-CyTM5.5小鼠抗人CD4抗体2.5 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤后加入固定破膜剂250 μL，4 ℃避光孵育20 min。使用通透清洗缓冲液(1×)洗涤细胞2次，将PE标记的小鼠抗人IL-17A及同型对照PE Mouse IgG1κ各12 μL分别加入到样本管和对照管中，4 ℃避光孵育30 min。使用通透清洗缓冲液(1×)洗涤细胞2次后加入通透清洗缓冲液(1×)重悬，4 ℃冰箱避光保存，24 h内上流式细胞仪检测，计算CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴细胞比值。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测FOXP3及视黄酸受体相关孤儿受体γt mRNA的表达：采用TRIzol试剂提取外周血单核淋巴细胞总RNA，然后反转录为cDNA，以此为模板行PCR扩增。FOXP3上游引物序列为TCCCAGAGTTCCTCCACAAC，下游引物为ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT，退火温度为60 ℃，PCR产物为122 bp；视黄酸受体相关孤儿受体γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t,RORγt)上游引物序列为CTCTGCAAGACTCATCGCCA，下游引物序列为CCACAGGTGACTCGGTTTCA，退火温度为60 ℃，PCR产物为184 bp。内参α-actin的上游引物序列为CAGGCACCAGGGCGTGAT，下游引物序列为TAGCAACGTACATGGCTGGG，PCR产物为293 bp。PCR反应体系总体积20 μL，包括Mix 10 μL、上游引物0.6 μL(10 μM)、下游引物0.6 μL(10 μM)、cDNA 1 μL，双蒸水7.8 μL。PCR反应条件为预变性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环；60 ℃收集荧光信号。扩增结束后，按仪器默认条件收集荧光，分别测定待测样本目的基因及内参基因的Ct值。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.3.5 ELISA检测血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平：采集外周血2 mL，装入真空干燥管内，室温下静置2 h，4 ℃、2 000 r/min离心15 min。按照ELISA试剂盒说明书的步骤，检测血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用[M(P25,P75)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴细胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴细胞比值的比较 RIF组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴细胞比值低于对照组，而CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴细胞比值高于对照组(均P<0.05)。见表1、图1、图2。

表1 两组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴细胞比值及CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴细胞比值的比较(x±s)

图1 两组外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg的检测结果

图2 两组外周血CD4+IL-17A+Th17的检测结果

2.2 两组外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA表达量的比较 RIF组FOXP3 mRNA表达量低于对照组，而RORγt mRNA表达量高于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组外周血FOXP3 mRNA及RORγt mRNA相对表达量的比较(x±s)

2.3 两组血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比较 与对照组比较，RIF组Treg相关的细胞因子TGF-β1和IL-10水平偏低，而与Th17相关的细胞因子IL-6、IL-17A和IL-23水平偏高(均P<0.05)。见表3。

表3 两组血清TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17A、IL-23水平的比较

3 讨 论

在胚胎移植过程中，具有移植潜能的优质胚胎及良好的子宫内膜内环境对于胚胎移植的成功有着至关重要的作用。但对于RIF患者，即使存在优质胚胎，仍然无法获得成功妊娠。研究表明，免疫特别是免疫耐受的相关基因及细胞因子，在胚胎移植过程及妊娠维持中具有至关重要的作用[8-9]。最新研究显示，约有81.7%的RIF患者存在子宫内膜免疫失调[10]，RIF的发生可能与子宫内膜免疫平衡遭到破坏致使免疫耐受下降有关。

近年来，越来越多证据表明，Th17和Treg参与妊娠的建立和维持[3，11]，其中Treg在胚胎植入时发挥重要作用[12]。Treg属于抑制性CD4+T淋巴细胞亚群，在阻止同种异体移植排斥中发挥极其重要的作用[13]，其通过表达TGF-β、IL-10、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4等因子来发挥免疫调节作用[14]。Treg能抑制由胎儿引起的免疫反应，其数量的减少与生殖失败相关[15-16]。此外，外周血和子宫内膜Treg数量的增加在分泌中期的胚胎移植过程中发挥重要作用[17]。FOXP3是在Treg上特异性表达的标志物，也是初始T淋巴细胞被诱导成Treg的主要基因[18]。因此，本研究将Treg定义为CD4+CD25+FOXP3+Treg，取代以往较多研究所采用的CD4+CD25+Treg，以便能更好、更真实地评估Treg的作用。Th17可分泌细胞因子IL-17，从而促进炎症、自身免疫和移植排斥的发生[19]。RORγt是决定Th17分化的主要转录因子，特异性表达于T淋巴细胞，其功能是调节胸腺和外周血中效应T淋巴细胞的发育及分化，诱导和刺激效应性T淋巴细胞Th17分泌促炎细胞因子[20]。因此，RORγt在某种程度上能反映Th17的功能活性及细胞数量水平。在没有第二信号促炎细胞因子存在的免疫环境下，FOXP3能抑制RORγt同时朝向Treg分化[20]。

蜕膜组织的T淋巴细胞变化最能直接反映母胎界面的免疫环境，但在实际工作中却很难采集胚胎植入后种植部位的蜕膜组织。有研究表明，蜕膜细胞的Treg可能是在胚胎移植后从外周血Treg池募集而来的[21]。人Treg能从外周血选择性迁移到蜕膜组织上，妊娠早期蜕膜组织CD4+CD25+Treg的数量约为外周血的3倍[22]，而且蜕膜组织Treg水平的降低与外周血Treg水平降低有关[23]。有研究者认为，外周血Treg的比例可能是一个预测体外受精治疗获得良好结局的新指标，胚胎移植成功的体外受精患者的外周血Treg比例高于失败者，同时外周血单核淋巴细胞中FOXP3的mRNA表达量也显著升高[24]。此外，有研究者认为，外周血和子宫内膜FOXP3+Treg在排卵前就发生增殖，其也许是潜在性地准备接受妊娠相关的抗原刺激，以便在分泌中期胚胎植入阶段发挥免疫耐受作用[17，25-26]。效应性T淋巴细胞与Treg的平衡可能从围植入期就开始发生改变。因此，本研究通过检测月经周期的增殖晚期外周血的Th17/Treg平衡情况，间接反映种植窗期子宫内膜免疫环境的变化。

有研究显示，与正常健康妊娠妇女相比，URSA患者外周血CD4+CD25brightFOXP3+Treg减少，而Th17增加，Th17/Treg比值高于正常妊娠和未妊娠妇女[27]。此外，URSA患者外周血中Th17相关的转录因子RORγt表达升高[28]。有学者认为，RIF是URSA的早期表现，二者之间似存在相同的免疫调节机制[29]。因此，我们推测RIF同样存在Th17/Treg失衡。本研究通过流式细胞术检测发现，RIF组外周血CD4+IL-17A+Th17/CD4+T淋巴细胞比值高于对照组，而CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T淋巴细胞比值低于对照组(均P<0.05)，与Ghaebi等[5]的研究结果相似，这提示RIF患者存在Th17/Treg的表达失衡。因此，对于RIF患者，在排除胚胎和内膜因素异常后，可通过检测外周血Th17和Treg比例以了解RIF患者机体是否存在二者的表达失衡，从而为RIF患者进行免疫治疗提供依据。本研究通过实时荧光定量PCR检测发现，RIF组Treg相关转录因子FOXP3的mRNA表达量低于对照组，而Th17相关转录因子RORγt的mRNA表达量高于对照组(均P<0.05)，这提示RIF患者机体Th17/Treg失衡也表现在细胞功能活性上。

研究表明，URSA患者外周血和蜕膜组织的Th17数量及其分泌的细胞因子IL-17较正常妊娠妇女明显升高，调控Th17增殖分化的相关分子如IL-6、IL-23、RORγt的水平也相应增高[28，30]。本研究结果显示，RIF组外周血中Treg分泌的细胞因子IL-10水平及与Treg分化相关的TGF-β1水平低于对照组，而与Th17分化相关的细胞因子IL-6、IL-23水平及Th17分泌的主要细胞因子IL-17A 水平则高于对照组(均P<0.05)，这提示在RIF患者体内低浓度的TGF-β1与高浓度的IL-6协同作用促使Th17偏移，从而形成Th17/Treg失衡的免疫环境，这与URSA的相关研究结果[6]相似。这说明RIF的发生可能与Th17/Treg失衡有关，两者的平衡向Th17偏移，Th17通过抑制机体的免疫调节功能以增强炎性免疫反应是可能引起早期妊娠失败的原因，因此维持Th17/Treg平衡对妊娠成功与否极其重要。

综上所述，RIF的发生可能与Th17/Treg失衡有关，这或许可为RIF的治疗提供新的依据及治疗方向，以往成功治疗URSA的手段也许同样可用于RIF患者。