单核苷酸多态性微阵列芯片技术在羊水过多孕妇遗传学病因中的应用效果▲

黄 婧 潘平山 蒙达华 王林琳

(广西壮族自治区妇幼保健院优生遗传门诊，广西南宁市 530003)

羊水是胎儿在母体宫内生存所不可缺少的重要成分，主要来源于母体血清经胎膜进入羊膜腔的透析液、胎肺分泌液、脐带华通氏胶及胎儿皮肤渗出液[1]。正常妊娠时羊水的产生与吸收处于动态平衡，而羊水产生和吸收失衡将导致羊水量异常。羊水过多是一种常见的妊娠期并发症，发生率为1%～3%[2]。妊娠期间羊水量超过2 000 mL即为羊水过多，超声表现为最大羊水暗区垂直深度≥8 cm或羊水指数≥25 cm[3]。羊水过多对胎儿危害较大，是妊娠不良结局的重要原因之一。羊水过多的病因十分复杂，有研究表明染色体异常等遗传病是羊水过多的重要因素之一[3]。染色体微阵列分析技术可以在基因组水平上检测染色体拷贝数变异(copy number variation，CNV)，同时可检测染色体嵌合体(嵌合比例>20%)、杂合性缺失、单亲二倍体等，目前已被广泛应用于诊断胎儿结构畸形、原发性智力低下、生长发育迟缓、自闭症、多发畸形及肿瘤等遗传学领域[4]。本文通过回顾性分析407例羊水过多孕妇的产前诊断检测结果，探讨单核苷酸多态性微阵列芯片(single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array)技术在羊水过多孕妇产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2016年1月至2019年 12月就诊于广西壮族自治区妇幼保健院的407例妊娠中晚期羊水过多孕妇的临床资料，孕周均≥17周，年龄20～42(30.16±3.42)岁。纳入标准：产前超声筛查发现羊水过多的孕妇；接受抽取羊水或脐带血进行染色体核型分析及SNP-array检测的孕妇；孕妇及家属对本研究知情同意。排除标准：不能配合行羊膜腔或脐静脉穿刺者，存在羊膜腔或脐静脉穿刺术禁忌证者。

1.2 研究方法 所有孕妇均接受检测前的遗传咨询并签署知情同意书。对于孕17～22周的孕妇，在B超腹部探头引导下行经腹羊膜腔穿刺并抽取羊水30 mL，对于孕周>22周的孕妇，在B超腹部探头引导下行经腹脐静脉穿刺并抽取脐带血1.5 mL，进行染色体核型分析及SNP-array检测。30 mL羊水中，20 mL用于染色体核型分析，10 mL用于SNP-array检测；1.5 mL脐带血中，0.5 mL用于染色体核型分析，1 mL用于SNP-array检测。

1.2.1 染色体核型分析：对获取的样本进行细胞培养。取20 mL羊水标本接种至培养瓶中进行培养，7 d后用10 μg/mL的秋水仙素干预3.5 h以阻断细胞有丝分裂，当细胞处于中期分裂相时，使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，经离心、低渗处理、固定后，将调整为适合浓度的细胞悬液进行滴片、烤片、制片，第2天进行G显带分析。取0.5 mL脐带血标本接种到淋巴细胞培养液中，培养68～72 h后用40 μg/mL秋水仙素干预15 min以阻断细胞有丝分裂，获取中期分裂相细胞，经离心、低渗处理、固定后，将调整为适合浓度的悬液进行滴片、烤片、制片，第2天进行G显带分析。每份标本至少计数20个分裂相，分析5个核型。若发现嵌合体核型则增加计数至100个分裂相。参照人类细胞遗传学国际命名体制(2016)进行染色体核型命名。

1.2.2 SNP-array检测：采用Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂盒(厦门致善生物科技有限公司，批号：200116)提取脐带血标本中的基因组DNA；采用微量样品基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，批号：DP316]提取羊水标本中的基因组DNA。采用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度及纯度。采用美国Illumina公司的HumanCytoSNP-12芯片进行SNP-array分析，根据标准操作流程对基因组DNA依次进行全基因组扩增、片段化、杂交和荧光染色，采用美国Illumina公司的iScan芯片扫描仪对制备的基因芯片进行扫描，获得的数据采用KaryoStudio 1.4.3软件进行分析。数据分析参照本实验内部数据库及正常人基因组变异数据库DGV(http://dgv.tcag.ca/)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk)、UCSC Genome Browser(https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu)、在线《人类孟德尔遗传》(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://omim.org/)等公共在线数据库。

2 结 果

2.1 染色体核型分析结果 407例羊水过多孕妇中，染色体核型异常24例，检出率为5.90%(24/407)，其中21-三体综合征14例，18-三体综合征4例，超雄综合征1例，染色体缺失/重复5例。

2.2 SNP-array检测结果 407例羊水过多孕妇中，SNP-array检测检出66例芯片异常，检出率为16.22%(66/407)。66例芯片异常包括33例致病性CNV和33例临床意义不明CNV。33例致病性CNV中，24例的检测结果与染色体核型分析结果一致，另9例染色体核型分析未见异常但SNP-array检测检出染色体微缺失/微重复综合征。见表1。

表1 9例微缺失/微重复综合征孕妇的SNP-array检测结果

3 讨 论

羊水过多时子宫张力增高，影响孕妇休息，使血压升高、子宫血供不佳，导致子宫、胎盘发生缺血缺氧。羊水过多除了容易导致胎膜早破、早产，还可以引起胎盘早剥，同时，羊水过多引起的子宫肌纤维过度伸展可致子宫收缩乏力，增加产后出血的发生风险[4]。羊水过多会干扰胎儿的生长环境，使得胎儿频繁活动，进而导致胎位不正及脐带绕颈，严重者可导致胎儿宫内窘迫甚至胎死腹中[5]。2018年美国母胎医学会发布了相关指南[6]，该指南详细阐述了羊水过多的诊断标准、病因及围产期管理措施，建议确诊羊水过多后应首先进行病因分析，根据病因给予相应临床处理。Blitz等[7]的研究表明，在羊水过多合并或不合并B超其他异常的胎儿中，染色体非整倍体的发生率分别为10%和1%。另外，部分孕妇由于只存在羊水过多的单一指征，未给予足够的重视，导致胎儿出生后出现各类代谢性综合征、神经肌肉病等遗传性疾病。因此，对羊水过多的孕妇进行产前遗传学诊断，对指导优生优育、提高出生人口质量、减少出生缺陷具有重要意义。

染色体微阵列分析技术能够在全基因组水平上检测染色体CNV，弥补常规核型分析无法检出亚显微异常的不足。其中，SNP-array技术是对患者DNA进行荧光标记并杂交到芯片上，与来源于数据库的标准人类基因组正常序列进行比对，从而发现患者DNA拷贝数变化的一项技术。SNP-array技术除了能够检测出CNV，还能够检测出杂合性缺失、单亲二倍体、三倍体(和其他多倍体)及一定比例的嵌合体[8]。在核型分析结果正常的遗传咨询者中，SNP-array技术可以额外检测出某些致病性基因组不平衡或遗传突变[9]。近年来研究表明，CNV也与羊水过多密切相关[10-11]。SNP-array技术已被国内与国际细胞遗传协会推荐为胎儿超声异常的首选检查方法[12-13]。本研究407例羊水过多孕妇中，染色体核型分析检出染色体核型异常24例，检出率为5.90%(24/407)，SNP-array检出66例芯片异常，检出率为16.22%(66/407)，66例芯片异常包括33例致病性CNV和33例临床意义不明CNV；33例致病性CNV中，24例与染色体核型分析结果一致，包括14例21-三体综合征、4例18-三体综合征、1例超雄综合征和5例染色体缺失/重复，其余9例为染色体核型分析未见异常但SNP-array检出染色体微缺失/微重复综合征。这提示SNP-array技术对非整倍体和不平衡性染色体数量重排的检出率与传统核型分析方法相近，并具有更高的分辨率。

本研究SNP-array技术额外检出的9例致病性染色体微缺失/微重复综合征病例中，病例1检测到16号染色体p13.3区域存在约0.05 Mb的纯合缺失，为致病性CNV，该缺失片段包含2个致病性OMIM基因：糖化血红蛋白A1型(glycosylated hemoglobin type A1,HBA1)和糖化血红蛋白A2型(glycosylated hemoglobin type A2,HBA2)。这两个基因均与地中海贫血有关，双基因纯合缺失可导致严重的地中海贫血症状。病例2缺失片段包含黑色素瘤抗原家族D2(melanoma antigen family D2,MAGED2)基因，而MAGED2基因对于胎儿肾脏再吸收钠盐、保持羊水平衡并维持妊娠具有重要作用，该基因突变与暂时性Bartter综合征相关，为X连锁隐性遗传。有文献报告，导致MAGED2基因功能丧失的突变可引起羊水过多及早产，还可引起严重但暂时的产前Bartter综合征[14]。病例3中1q21.1区域片段重复部分与1q21.1重复综合征有关，包含关键基因AMP活化型蛋白激酶β2(非催化亚型)(protein kinase,AMP-activated,beta 2 non-catalytic subunit,PRKAB2)和缝隙连接蛋白α-5(gap junction protein alpha-5,GJA5)，1q21.1重复区域外显率不全，表现度可变，患者具有广泛的临床表现，包括发育迟缓、心脏畸形、轻度特殊面容等，但部分患者亦可无明显临床表现。研究表明，1q21.1区域的重复与先天性心脏病相关，其中GJA5基因的CNV与心脏发育异常相关[15]。病例4检出的16p13.3区域缺失片段包含HBA1和HBA2基因，与地中海贫血有关；此外，该病例中Yq11.222q11.223缺失区域涉及Y染色体无精子因子b(azoospermia factor b ,AZFb)区域，AZFb区域整段缺失的患者可存在唯支持细胞综合征或生精阻滞的典型睾丸组织学特征，其临床表现主要为少弱精子症[16]。研究显示，AZFb区域部分缺失的男性能够自然生育带有同样Y染色体缺失的后代[17]，因此笔者建议对此类患者进一步行胎儿产前α地中海贫血基因检测、Y染色体缺失检测及父亲Y染色体验证。病例5检出3号染色体短臂缺失，这可导致3pter-p25缺失综合征，该病的常见临床表现为宫内发育迟缓、低出生体重、小头畸形、三角头、肌张力低下、精神发育迟缓、上睑下垂、内眦、小颌畸形等。病例6与病例9均检测到22q11.21区域存在片段缺失，表现为DiGeorge综合征，该病缺失的关键基因为T-box转录因子1(T-box transcription factor 1,TBX1)，临床表现为胸腺发育不全、低血钙症、心脏(心血管)畸形、骨骼畸形、特殊面容、身材矮小、学习困难[18]。病例7检出2q13缺失基因组疾病，该病的主要临床表现为发育迟缓、小头畸形、智力障碍及先天畸形相关症状等[19-20]。病例8检出2q37.2 q37.3区域片段重复，其临床表现包括发育迟缓、伴或不伴显著的发育及形态学异常、肌张力低下等。

另外，本研究临床意义不明CNV的病例检出率为8.11%(33/407)，这类病例的结果解读与遗传咨询需结合孕妇及其丈夫的CNV检测结果，一般而言，若CNV为遗传性的，则临床意义较小，若为新发的，则临床意义较大，但仍需要考虑不完全外显和临床表型差异的影响。对于杂合性缺失是否需要报告，应以杂合性缺失区域内是否涉及严重的隐性遗传病基因为参考依据，如果涉及隐性遗传病相关基因，可在报告中建议行外显子测序以排除纯合致病基因突变的可能。

综上所述，对于中晚期羊水过多孕妇，在常规染色体核型分析的基础上进行SNP-array检测可获得更多的遗传学信息，有助于发现染色体核型分析无法检出的染色体亚显微结构异常，以及提高对羊水过多胎儿的遗传学病因诊断率，从而为羊水过多孕妇的胎儿预后评估及遗传咨询提供更优的临床决策。