基于SIRT1信号通路探究电针对肠易激综合征伴抑郁情绪的作用机制

冯袁辉，杨易辰，周子娴，张丽萍，张 鹏，任晓暄，陈俊陶，马惠芳△

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.唐山市丰南区中医医院，河北 唐山 063000；3.北京市朝阳区东风社区卫生服务中心，北京 100025；4.北京市朝阳区望京社区卫生服务中心，北京 100025)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种慢性的功能性胃肠疾病，伴随着肠道习惯的改变而出现腹痛，IBS在全球的患病率约为10%～25%[1]，我国的IBS患病率约为5%～7%[2]。IBS发病机制复杂，其病理生理学范围广泛，包括运动、内脏感觉和心理社会困扰等异常[3]。研究表明IBS患者常伴有抑郁障碍[4]。而IBS患者伴随的抑郁情绪可因胃肠道症状的缓解而随之改善[5]。但IBS伴抑郁情绪作用机制尚不明确，仍需要进一步探讨。

Sirtuins蛋白家族(SIRT)是一类具有NAD+依赖性脱乙酰酶活性或 ADP-核糖基转移酶活性的蛋白，属于第三类组蛋白去乙酰化酶。沉默信息调节因子1(Silent information regulator 1，SIRT1)是研究最广泛的sirtuin，存在于细胞核和细胞质中[6-7]。SIRT1不仅与IBS内脏痛密切相关[8]，SIRT1缺失会抑制环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein，CREB) mRNA的翻译，从而下调脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[9-10]，影响海马神经元突触的形态和功能，与抑郁情绪同样密切相关。小鼠经过慢性变化压力(Chronic variable stress，CVS)后，给予SIRT1抑制剂会导致小鼠出现焦虑样行为[11]。SIRT1信号通路的异常可能是IBS伴抑郁状态的病理基础之一。因此，本实验电针“天枢”“上巨虚”，观察其对IBS伴抑郁情绪大鼠胃肠症状和抑郁情绪的影响，并通过检测结肠组织SIRT1和海马组织中SIRT1、CREB及BDNF蛋白表达，探讨针刺对IBS伴抑郁情绪的作用机制，为针灸治疗IBS伴抑郁情绪的远端配穴提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级SD大鼠36只，8周龄，雄性，体质量220～250 g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养于北京中医药大学良乡校区动物房，饲养条件：光照周期12 h/12 h，光照 8：00—20：00，黑暗 20：00—8：00，室温23 ℃，湿度(55±5)%，每日定时清洁通风，每笼 3 只，动物可自由活动、进食水。大鼠随机分为空白组、模型组、电针组与西药组。实验开始前适应性喂养 7 d。实验中对动物的处置遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 试剂 二硝基苯磺酸(Dinitrobenzenesulfonic acid，上海晨易生物有限公司);毫针0.25 mm×13 mm(北京中研太和科技有限公司);直肠给药管(7号，四川益泰医疗器械有限公司);匹维溴铵片(北京万生药业有限责任公司);重组Anti-SIRT1抗体(ab189494，英国abcam公司);重组Anti-CREB抗体(ab32515，英国abcam公司);重组Anti-BDNF抗体 (ab108319，英国abcam公司)。

1.2.2 仪器 电针仪(长城牌KWD-808I，常州市武进长城医疗器械有限公司);包埋机(TB718，湖北泰维科技实业有限公司);切片机(RM2235，德国Leica);组织脱水机(ST5020，德国Leica);显微镜(Olympus×51，日本Olympus公司)。

1.3 造模方法

造模方法选择二硝基苯磺酸(DNBS)灌肠结合慢性束缚应激方法，创建IBS伴抑郁情绪大鼠模型。

1.3.1 DNBS灌肠 除空白组外，第7天禁食24 h，用棉棒轻触大鼠尾根部刺激排便，腹腔注射 7%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，滴有石蜡油的8 F 导尿管缓慢插入肛门8 cm，缓慢注入DNBS溶液(50 mg/kg，混入50%乙醇溶液1 mL中)于结肠，完成后保持大鼠头低位3 min，避免从肛门回流。空白组用等体积0.9%生理盐水灌肠，灌肠操作与造模组方法相同，常规喂养7 d以保证炎症形成。

1.3.2 慢性束缚应激 DNBS处理完成后，于第16天进行慢性束缚应激方法。将大鼠仰面置于鼠板上，用扎带固定颈下、腋下和盆骨上3个部位，并固定上肢，以“大”字形束缚，持续3 h。束缚结束后放回笼中常规饲养,持续7 d。

1.4 干预方法

干预操作在第24天进行。空白组：黑布包裹固定,20 min/d，不予其他处理。模型组：同空白组。电针组：黑布包裹固定后进行针刺。选择双侧“天枢” “上巨虚”。穴位定位参照《实验针灸学》(中国中医药出版社出版)。穴位定位：“天枢”位于大鼠腹部，脐中旁开5 mm，直刺4 mm；“上巨虚”位于腓骨小头下10 mm处，直刺7 mm。同侧天枢和上巨虚连接电针仪，疏密波，频率2/100 Hz， 强度以局部肌肉颤动为准，留针20 min。 西药组：匹维溴铵片(18 mg/kg，溶于1 mL 0.9%NaCl溶液中)灌胃处理。 以上处理方法1次/d，持续7 d。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 大鼠一般情况观察 实验过程中，于造模前、造模后和干预后记录大鼠的状态及日常行为，每周测量1次大鼠体质量和24 h进食量。

1.5.2 内脏敏感性测试 分别于造模前、造模后与干预后进行内脏敏感性测试，选择腹壁撤退反射[12](Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)检测进行评估。固定大鼠，球囊头端涂抹石蜡油后缓慢插入肛门约 8 cm，用胶布带与鼠尾固定，向自制直结肠扩张球囊中持续90 s注水使球囊扩张。标记起始收缩波的潜伏期和收缩波个数。每只30 min以上重复检测3次，取其平均值。

1.5.3 旷场实验(Open Field Test，OFT) 分别于造模前、造模后与干预后进行旷场实验[13]，测定大鼠在5 min内的中央区活动时间、中央区活动距离与总距离。

1.5.4 组织取材 行为学检测结束后立即取材。随机每组取6只大鼠，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取结肠及海马组织，4%多聚甲醛固定12～24 h后常规脱水、石蜡包埋，切片(厚度为4 μm)；另一部分保存于-80 ℃冰箱待蛋白检测。

1.5.5 Western Blot检测大鼠结肠SIRT1及海马SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表达情况 将结肠及海马组织用冷TBS洗涤,去血,剪碎置于匀浆器，RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆，将匀浆液转移至1.5 mL离心管中,振荡，冰浴30 min,裂解，12 000 r/min离心5 min,提取蛋白。制备SDS-PAGE凝胶，上样、电泳和转膜，5%脱脂牛奶封闭2～3 h，孵育一抗(SIRT1蛋白1∶300，CREB蛋白1∶300，BDNF蛋白1∶300，GAPDH 1∶2 000)洗膜，孵育二抗，ECL化学发光检测。

1.5.6 免疫组化法检测大鼠结肠SIRT1及海马SIRT1、CREB和BDNF蛋白的表达情况 石蜡切片常规脱蜡、水化后行抗原修复(具体操作严格按照试剂盒进行)，光学显微镜下观察，计算阳性表达平均吸光度值(AOD=IOD/A)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

2.1.1 空白组 大鼠毛色光滑，整体状态良好，动作迅速，反应敏捷，肛周洁净，粪便成型呈颗粒状。

2.1.2 模型组 造模前一般情况与空白组相同，造模后，大鼠毛色逐渐发黄，且1周后出现干枯现象，精神状态一般，粪便尚可成型，无秽臭味，黄色较软便，大鼠间偶有攻击及撕咬；DNBS 造模完成后，大鼠状态疲惫，毛发枯燥黄干，粪便稀溏，不成型，沾染肛周；慢性束缚应激方法造模后，大鼠精神萎靡不振，毛色焦黄易脱，反应不灵活，粪便稀溏，臭味浓，附着肛周，鼠间有撕咬现象，偶有舔舐腹部，畏惧实验人员，甚有抓咬现象。

2.1.3 电针组 造模前与空白组相似;造模期间，与模型组相似；造模及干预7 d后，大鼠反应速度尚可，毛发光泽度变亮，干枯改善，畏惧及撕咬现象减轻，肛周附着少量黄色物，粪便基本成型，无臭秽气味。

2.1.4 西药组 造模前与空白组相似;造模期间，与模型组相似；造模及干预7 d后，大鼠反应速度尚可，毛发光泽度变亮，干枯改善，畏惧及撕咬现象减轻，肛周附着少量黄色物，粪便基本成型，个别大鼠排出稀便，无臭秽气味。

2.2 各组大鼠体质量及 24 h进食量比较

与空白组比较，模型组体质量、24 h进食量降低(P<0.01或P<0.05)，而电针组、西药组可有效增加体质量及进食量(P<0.01或P<0.05)。电针组与西药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1～2。

表1 各组大鼠体质量结果

表2 各组大鼠24 h进食量比较

2.3 各组大鼠AWR实验结果比较

干预后，模型组的第1次收缩波潜伏期明显低于空白组(P<0.01)，电针组和西药组明显高于模型组(P<0.01)；90 s内收缩波个数比较，模型组明显高于空白组(P<0.01)，电针组与西药组低于模型组(P<0.05)。见表3～4。

表3 各组大鼠第1次收缩波潜伏期比较

表4 各组大鼠90 s内收缩波个数比较

2.4 各组大鼠旷场实验结果

干预后，模型组中央区活动时间、中央区活动距离和总距离皆明显低于空白组(P<0.01)，电针组及西药组高于模型组(P<0.05或P<0.01)。见表5。

表5 干预后各组大鼠旷场实验结果

2.5 结肠组织SIRT1蛋白表达量

Western blot法检测显示，干预后，模型组结肠组织中SIRT1蛋白表达量明显低于空白组(P<0.01)，电针组及西药组结肠组织中SIRT1蛋白表达量与模型组比升高(P<0.01)。见图1、表6。

表6 各组大鼠结肠SIRT1蛋白表达量

免疫组织化学法检测示,阳性表达呈棕褐色，与空白组比较，模型组 SIRT1阳性表达减弱；与模型组比较，电针组及西药组阳性表达增强。SIRT1平均吸光度值，与空白组比较，模型组明显降低(P<0.01)；与模型组比较，电针组及西药组明显增加(P<0.01)。见图2、表7。

表7 各组大鼠结肠SIRT1平均吸光度比较

2.6 海马组织SIRT1、CREB和BDNF蛋白表达量

Western blot法检测显示，与空白组比较，模型组海马组织SIRT1、CREB及BDNF蛋白的表达减少(P<0.01);与模型组比较，电针组及西药组升高(P<0.05或P<0.01)。见图3、表8。

表8 各组大鼠海马SIRT1、BDNF及CREB蛋白相对表达量

免疫组织化学法检测示,阳性表达呈棕褐色,与空白组比较，模型组SIRT1、CREB及BDNF阳性表达减弱；与模型组比较，电针组及西药组SIRT1、CREB及BDNF阳性表达增强。平均吸光度值，与空白组比较，模型组明显降低(P<0.01)；与模型组比较，电针组及西药组明显增加(P<0.01或P<0.05)。见图4、表9。

表9 各组大鼠海马组SIRT1、BDNF及CREB平均吸光度比较

3 讨论

目前现代医学认为肠易激综合征的病因尚未明了，病因学的研究主要涉及饮食因素、精神心理因素、遗传因素、感染因素及免疫因素等，肠易激综合征是一种多因素异质性疾病，其机制与胃肠动力学异常、内脏高敏感性与脑-肠轴异常等有关[14]。一项为期 12 年的研究显示，基线时无精神心理异常的IBS 患者在随访期发展为抑郁的风险是无任何功能性胃肠病健康对照组的1.10倍[15]。其主要机制可以用“脑-肠轴”学说来解释，“脑-肠轴”学说是指肠道与大脑之间的双向沟通，负性情绪通过“脑-肠轴”在肠道功能中起着重要作用[16-17]。当啮齿类动物受到慢性压力等负向情绪时，海马体是大脑中最敏感的区域之一，慢性应激暴露的啮齿动物的海马结构可塑性损伤[18-19]，神经元负责整合和传递信号，响应内在和外在的信息[20]，影响突触连接的神经可塑性，以平衡脑功能。研究表明，神经可塑性功能障碍是抑郁症的基本发病机制[21]。因此，海马结构可塑性功能障碍可能参与IBS 伴抑郁情绪发病。

Caruso R等[22]研究发现在IBD患者的结肠活检中，SIRT1表达量下调。SIRT1在老年小鼠肠上皮特异性敲除后会引起自发炎症和结肠组织损伤，增加其对结肠炎的易感性[23]。白藜芦醇诱导大鼠产生的SIRT1通过NF-κB下调炎症，对急性肠道炎症有保护作用[24-25]。大建中汤对IBS能通过在基因及蛋白水平上促进SIRT1表达，激活SIRT1/NF-κB p65信号通路以达到治疗IBS内脏痛的目的[26]。SIRT1信号通路是治疗IBS一条潜在的通络。

本研究使用联合造模法[27-28]，腹壁撤退反射以示大鼠肠道对压力刺激的痛觉敏感度，是 IBS模型制备成功的标准[29]。在本实验中，AWR潜伏期明显缩短、收缩波个数明显增多，说明IBS造模成功。IBS 中医中属“腹痛”“泄泻”等疾病范畴，中医认为其病位在肠。天枢穴，大肠经募穴，具有疏调肠腑、导滞通便的功效[30]。上巨虚，大肠经的下合穴，善理气化滞、通调肠腑。经研究“合募配穴”治疗肠易激综合征疗效显著[31]。因此，本实验选用电针大肠经“合募配穴”，即“天枢”“上巨虚”，电针治疗后，AWR收缩波潜伏期增长，收缩个数降低，说明IBS大鼠内脏敏感性降低。而IBS大鼠结肠SIRT1表达量降低，电针治疗后SIRT1表达量增高，说明电针可调控结肠SIRT1表达量，激活了结肠SIRT1信号。

SIRT1也是大脑中一种重要的调节因子，特别是在海马体、基底神经节和前额叶皮质中[32]。既往研究[33]表明，SIRT1调节神经元分化、保护和突触可塑性，这些功能与认知功能主要相关。海马中 SIRT1具有抗抑郁的作用，慢性不可预测温和应激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)建模的抑郁大鼠海马齿状回的SIRT1活性降低[34]。既往研究发现，SIRT1缺失会导致突触可塑性损伤，BDNF和CREB表达降低[35]。而脑源性神经营养因子BDNF是神经元活动和突触可塑性之间的调节器[33]，BDNF的改变是神经可塑性受损的基础[36]，CREB又是调节BDNF和记忆形成的重要转录因子[37]，CUMS暴露降低CREB/BDNF的表达，而电针及西药上调CREB磷酸化，促进CREB下游靶基因BDNF的转录[38]，调节神经可塑性损伤。

本实验电针治疗后，中央区活动时间、中央区活动距离与总距离皆明显增加，说明经过电针干预后，IBS 大鼠抑郁情绪得到一定的缓解。检测海马组织SIRT1、BDNF及CREB结果表明其表达量均降低，即IBS伴抑郁情绪大鼠海马组织SIRT1、 BDNF及CREB表达下调。以往研究[10]表明 SIRT1可介导CREB和BDNF表达，SIRT1缺失导致miR-134表达上调，抑制CREB mRNA翻译，下调CREB和BDNF，导致突触可塑性和记忆受损。近期研究[39-41]发现抗抑郁药治疗抑郁小鼠，可能是通过 cAMP/CREB/BDNF信号通路，上调海马CREB、p CREB及BDNF水平，修复突触可塑性，保护神经可塑性，进而改善抑郁小鼠的认知行为。本实验结果表明电针上调了大鼠海马SIRT1、BDNF及CREB蛋白的表达，抑郁情绪得以改善，这与以往的研究相符。由此，笔者认为电针可调控结肠SIRT1表达量，可能通过肠道与大脑之间的双向沟通，激活了海马组织 SIRT1/CREB/BDNF信号通路，这可能是电针对肠易激综合征伴抑郁情绪的潜在作用机制。