“秩边”透“水道”针法对早发性卵巢功能不全大鼠HPO轴和Bcl-2、Bax蛋白的影响研究

马梦娜，司佳弘，金晓飞△，李佳茹，闫 婧

(1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450000)

早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)是40岁以下女性出现卵巢功能衰退，主要以经水稀少或断绝、雌激素值低而促性腺激素值高为特征[1]。国际流行病学调查显示≤40岁女性的患病率约为1%[2]，而我国≤40岁女性的患病率约为2.8%，且逐年上升，影响女性的身心健康[3]。现阶段西医治疗主要采用激素替代疗法，此疗法虽能够改善患者月经不调、低雌激素水平症状，但其有严格的适用人群，且需长期服药，增大了患者罹患妇科肿瘤的风险[4-5]，故探讨更安全有效的疗法用于防治POI成为该领域的热点问题。

近年来，针灸疗法以安全系数高、副作用小和疗效显著的优势愈来愈被大家认可[6]。“秩边”透“水道”针法是用芒针从“秩边”穴透向“水道”穴为主的针刺疗法，由山西中医药大学冀来喜团队根据先贤经验选取的对穴，并规范了安全进针的角度和深度发展形成，通过调整针刺的角度使针感传向不同的部位，治疗不同的疾病；当针尖朝向水道穴方向使针感传导至前阴部时，能够治疗前列腺病[7]、痛经[8]、多囊卵巢综合征[9]和继发性闭经[10]等疾病。基于此，本实验通过建立POI大鼠模型，探讨“秩边”透“水道”针法对POI大鼠的作用机制，为临床应用“秩边”透“水道”针法制定有效防治POI的方案提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其分组

8周龄，体质量180～220 g，健康雌性SD大鼠60只购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2016-0006]，严格按照山西中医药大学实验中心要求规范操作，室内温度控制在23～27 ℃，室内相对湿度控制在50%～60%，大鼠摄食饮水自由，适应性喂养1周后随机分为空白组、模型组、秩边组、普针组与西药组，每组12只。

1.2 主要试剂与仪器

环磷酰胺(0.2 g/瓶，江苏恒瑞制药厂);针灸针具0.15 mm×25 mm(北京中研太和医疗器械有限公司);戊酸雌二醇片(1 mg/片，拜耳医药公司);Estra-diol (E2)、luteotro hormone(LH)、Follicle-stimulating hormone (FSH)ELISA试剂盒、Bcl-2及Bax抗体(武汉博士德生物工程有限公司);UB102i生物显微镜(重庆市奥普光电公司);高速离心机HC-3018(安徽中科中佳科学仪器有限公司);酶标检测仪SM600(上海永创医疗器械有限公司)。

1.3 动物模型制备

本实验参考POI大鼠模型建立的相关文献[11]，通过腹腔注射环磷酰胺建立该模型：模型和干预组大鼠在第1天腹腔注射50 mg/kg剂量环磷酰胺，再以8 mg/kg连续腹腔注射14 d。从造模第8天起每天镜下检测大鼠阴道细胞涂片：将无菌棉签浸入生理盐水，取出后轻轻插入大鼠阴道内，顺时针转动4～5圈后取出，均匀涂抹在载玻片上，晾干后进行HE染色，光学显微镜(100×)下观察大鼠阴道脱落细胞情况。根据大鼠动情周期标准[12]，判断造模结束时有两只大鼠动情周期仍然正常，被剔除实验，其余大鼠进入治疗阶段。

1.4 干预方法

1.4.1 秩边组 依据《实验针灸学》[13]结合动物骨性标志特征定位腧穴。秩边组：定位“秩边”穴(在大鼠臀部外侧，股骨大转子与第四荐骨连线的中点的骨性缝隙处)，消毒，选用0.15 mm×25 mm规格毫针从“秩边”穴刺向同侧“水道”穴方向，深度约为12 mm，隔日针刺，每次留针30 min，治疗1个月。

1.4.2 普通针刺组 定位“三阴交”(内踝尖上约10 mm)、“关元”(脐下约25 mm)和“肾俞”(第2腰椎棘突下旁开7 mm)穴，消毒，选用0.15 mm×25 mm规格毫针进针，三阴交穴约进针2 mm，关元穴约进针5～8 mm，肾俞穴约进针5 mm，隔日针刺，每次留针30 min，治疗1个月。

1.4.3 西药组 将戊酸雌二醇片用生理盐水配置成浓度为0.01 mg/mL溶液，按照0.09 mg/(kg·d)(根据人鼠比例换算后用药量)剂量灌胃，1次/d，治疗1个月。

1.4.4 空白组和模型组 正常饲养，不予干预。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 取材 治疗结束，禁食12 h、不禁水，用10%水合氯醛麻醉大鼠，开腹采集腹主动脉血，室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，取上清后置于-80 ℃冰箱用以后续ELISA检测。摘取大鼠的双侧卵巢，用生理盐水冲洗干净，在滤纸上吸干，称重；左侧卵巢用4%中性多聚甲醛固定；右侧卵巢放入冻存管中经液氮冻存后放入-80 ℃冰箱保存，以备后续蛋白测定。

1.5.2 检测 卵巢系数(%)=卵巢重量(mg)/大鼠体质量(g)×100%。按ELISA试剂盒说明书要求检测大鼠血清中FSH、LH及E2水平。从多聚甲醛中取出左侧卵巢组织，清水冲洗干净，修剪多余的脂肪组织，经脱水、透明、包埋、切片(厚5 μm)、HE染色和封片，显微镜下观察卵巢病理变化。右侧卵巢组织匀浆取上清，测定蛋白浓度，加热变性后电泳、转膜，稀释一抗(Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜孵育二抗(HRP-羊抗兔IgG 1∶3 000)，滴加ECL溶液曝光显像，成像分析仪自动成像，软件ImageJ 分析目的蛋白和内参条带灰度值比值，计算目的蛋白表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠动情周期涂片

动情前期：以有核上皮细胞为主，伴少数角化上皮细胞；动情期：满视野的角化上皮细胞；动情后期：可见数量明显的，相差无几的有核上皮细胞、角化上皮细胞和白细胞；动情间期：以白细胞为主，伴有极少数上皮细胞。见图1。

2.2 大鼠卵巢组织形态学变化

空白组卵巢组织清晰，含有数量丰富的生长卵泡，颗粒细胞排列规则，闭锁卵泡较少；模型组生长卵泡几不可见，可见大量有皱缩透明带残余的闭锁卵泡，颗粒细胞排列无规则，渗入卵泡液中；秩边、普针及西药组较模型组均可见生长卵泡增多，闭锁卵泡减少，其中秩边和西药组的生长卵泡数量较普针组增多。见图2。

2.3 各组大鼠卵巢指数、FSH、LH及E2水平变化

与空白组比较，模型组和普针组大鼠的卵巢指数明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，秩边和西药组卵巢指数增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，普针组略有增加，差异无统计学意义(P>0.05)；与秩边组比较，普针组卵巢指数降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，西药组卵巢指数增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组、普针组FSH水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，干预组FSH水平均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与秩边组比较，普针组FSH水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，西药组FSH水平略高，差异无统计学意义(P>0.05)。 与空白组比较，模型组LH水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，干预组LH含量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与秩边组比较，普针组LH水平略高，西药组LH水平略低，差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，模型组及干预组E2水平均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，干预组E2水平均明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与秩边组比较，普针组E2水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，西药组E2水平略高，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠卵巢指数、FSH、LH及E2水平比较

2.4 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2和Bax蛋白水平比较

2.4.1 Bcl-2水平 与空白组比较，模型组和干预组Bcl-2水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，秩边组和西药组Bcl-2水平明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，普针组Bcl-2水平稍有增加，差异无统计学意义(P>0.05)；与秩边组比较，普针组Bcl-2水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，西药组Bcl-2水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

2.4.2 Bax水平 与空白组比较，模型组Bax水平明显上升，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，干预组Bax水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与秩边组比较，普针组Bax水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，西药组Bax水平略高，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

2.4.3 Bcl-2/Bax值 与空白组比较，模型组和干预组Bcl-2/Bax水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，干预组Bcl-2/Bax水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与秩边组比较，普针组Bcl-2/Bax水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，西药组Bcl-2/Bax水平略低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

表2 大鼠卵巢组织中 Bcl-2、Bax蛋白水平比较

3 讨论

中医认为POI病机以肾虚为本，系经络不通、卵巢失养所致[14]。“秩边”透“水道”针法是用芒针透刺，进入盆腔深部，刺激盆丛神经，一方面补肾填精、祛瘀通络，调和局部气血运行以滋养卵巢[9]；另一方面通过刺激盆从神经的交感和副交感神经，恢复正常的内分泌功能[15]。普针组选穴依据[16]为检索与POI相关文献选取排名前三的腧穴(“肾俞”“关元”“三阴交”)组合，具有调节肾、肝、脾三脏功能、通冲任和益气血之效。戊酸雌二醇是临床常用来治疗女性闭经、卵巢早衰等疾病的雌激素药物[17]，选用此药物作为西药对照。

HPO轴通过调节女性月经周期以及性激素水平，从而维持女性正常的生育功能[18]：下丘脑合成释放促性腺激素释放激素刺激垂体，激发其合成分泌FSH和LH作用于卵巢，促进卵泡发育、排卵和E2的释放，E2可通过HPO轴再反向作用于垂体。HPO轴这种正、负反馈的双重调节作用使得女性的月经周期和内分泌水平保持动态平衡[19]。HPO轴紊乱是POI的主要发病因素之一，通过调节紊乱的HPO轴，可以使多数卵巢功能衰退的女性月经周期恢复正常[20]。

研究[21-22]证实颗粒细胞具有供给卵母细胞所需能量和促进卵泡发育的功能，当颗粒细胞凋亡时，卵母细胞不再发育而形成闭锁卵泡，故颗粒细胞凋亡与否是评价卵泡发育质量的关键据点。Bcl-2、Bax作为内源性(线粒体)凋亡途径的主要调节因子，是颗粒细胞凋亡的关键调控环节[23]。当Bcl-2表达增加时，线粒体膜电位增加，膜的通透性稳定，阻碍细胞色素C的释放，防止其激活下游的凋亡因子caspase家族，增强颗粒细胞对凋亡的抵抗力[24]。若Bax表达增加则会引起线粒体膜电位降低[25]，膜通透性增大，进而释放细胞色素C进入胞质内，激活caspase家族，加速了颗粒细胞的凋亡，导致卵泡闭锁[26]。

本实验结果表明：注射环磷酰胺后，大鼠动情周期紊乱，卵巢HE病理切片显示生长卵泡几不可见且含有大量闭锁卵泡，血清FSH、LH升高，E2降低，高度模拟了临床POI患者的特征，提示成功建立POI大鼠模型；秩边组、普针组及西药组可见多个生长卵泡，闭锁卵泡减少，E2升高,FSH、LH下降，表明经过针刺和西药干预，POI大鼠卵巢功能衰退的情况均有所改善，而且秩边组FSH、LH及E2水平优于普针组，和西药组无明显差异。从分子水平上，大鼠注射环磷酰胺后卵巢组织中Bcl-2水平下降，Bax水平增加；干预后发现，Bcl-2水平均有增加，Bax水平均有下降，其中秩边组和西药组中Bcl-2增加和Bax下降水平较普针组明显，提示“秩边”透“水道”针法通过调节细胞凋亡因子Bcl-2、Bax水平改善卵泡闭锁情况，显著优于普针组，和西药组疗效相当。“秩边”透“水道”针法以芒针同时刺激两穴，针刺穴位少，操作简便，能够减少针刺时大鼠的应激反应对实验的干扰，疗效显著，较普针组具有一定的优势。

综上所述，“秩边”透“水道”针法在一定程度上改善了POI大鼠病理状态，同时能够调节紊乱的HPO轴和提高抗凋亡能力，从而起到纠正大鼠衰退的卵巢功能的作用，其疗效优于普针组；作用机制可能与增加E2含量、减少FSH和LH含量、使HPO轴功能趋于正常、上调Bcl-2以及下调Bax蛋白水平从而减缓颗粒细胞凋亡速度和有效降低卵泡闭锁进程有关。