电针对腰椎间盘退变大鼠模型线粒体自噬影响的研究

陈延武,崔锦涛,康武林,袁普卫,王占魁△

(1.西安市中医医院，陕西 西安 710021；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.陕西中医药大学附属医院骨伤医院，陕西 咸阳 712000)

腰椎间盘退变(Lumbar intervertebral disc degenera-tion，LIDD)是诱发包括下腰痛(Low back pain，LBP)在内的一系列椎间盘相关疾病的最常见原因[1-3]。在一份报告中显示，成人慢性腰背疼痛的发生率达到了38.9%[4]，LBP已经是致使成人丧失劳动力的主要元凶之一[5-7]。

诸多研究认为，电针对腰椎间盘退变性疾病具有良好的治疗作用。单衍丽采用电针疗法对比药物治疗腰椎间盘突出症发现，电针可大幅改善腰椎间盘突出后症状并且优于药物治疗[8]。Carolyn E等学者也认为针刺对于腰痛的治疗是安全有效的，尤其在药物治疗不佳时，针刺治疗具有很好的替代性[9]。然而，针刺具体是通过何种途径治疗下腰痛、抑制椎间盘退变的，其具体作用机制目前相关研究尚不明确。线粒体自噬对于微环境的调控有重要的意义，它是通过细胞自噬的方式选择性地清除受损或者多余的线粒体，从而维持相对稳态。本研究笔者通过电针诱导腰椎间盘髓核细胞内线粒体自噬，分析其抑制LIDD的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(180±20)g[恩斯维尔实验动物中心，SCXK(陕)2018-001]。在陕西中医药大学南校区动物实验中心进行饲养，每笼5只，自由进食饮水，室温控制19～24 ℃，湿度45%～55%，待SD大鼠适应环境1周后即可开展动物实验。根据随机数表法随机分为4组：假手术组、模型组、电针组与假电针组，每组15只。

1.2 主要仪器设备、试剂与耗材

1.2.1 仪器设备 电子针疗仪(华佗牌电针仪，SDZ-Ⅱ型)；Micro-CT[布鲁克(北京)科技有限公司，SKYSCAN1276]；脱水机、包埋机和冻台(武汉俊杰电子，JJ-12J)；病理切片机(上海徕卡仪器，RM2016)；正置光学显微镜(日本尼康，NIKON ECLIPSE CI)；垂直电泳仪、转膜仪(美国伯乐实验室，Bio-Rad)；凝胶成像仪(上海勤翔仪器，Clinx)；低温高速离心机(德国艾本德，Eppendorf)等。

1.2.2 实验试剂及耗材 中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)；苏木素-伊红染液、RIPA裂解液(中)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMSF(UBI)；Cox2一抗(AF7003)；异氟烷(国药准字H19980141)；头孢呋辛钠(国药准字H20065708)；针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，0.3 mm×25 mm)等。

1.3 动物模型的建立及治疗方案

1.3.1 动物模型的建立 所有大鼠术前8 h禁食，4 h禁饮。根据付方达等[10]报道的方法复制LIDD大鼠动物模型：采用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，待麻醉起效后剃除目标节段脊柱区毛发，判别施术部位，分别用碘伏、酒精棉球消毒术区皮肤，确认手术部位后沿脊柱纵行向下锐性切开皮肤，钝性剥离筋膜，使大鼠的竖脊肌充分显露，并将两侧竖脊肌轴向钝性分离(必要时可切断部分竖脊肌)，完全显露大鼠腰椎棘突，以大鼠髂前上棘正对L5～6椎间隙进行定位，判别无误后彻底剪断腰L3～5节段的棘突、棘上及棘间韧带等组织结构，检查脏器无出血、腹膜完整后，碘伏彻底消毒，在伤口处涂抹适量头孢呋辛钠预防感染，将肌肉、筋膜和皮肤等创口逐层关闭。假手术组：仅行竖脊肌钝性分离，不咬除棘突及棘上及棘间韧带等结构，其余操作技术及手术方式同造模各组。

1.3.2 治疗方案 电针组大鼠选取双侧的夹脊穴L3～5，采用0.3 mm×25 mm毫针直刺0.5～0.7 cm(避免伤及脊髓),快速捻转刺入腧穴，针下有沉涩感后，针柄连接电针仪，同对电极应连接同节段椎体的腧穴，仪器参数设置：疏密波，2 Hz/15 Hz，强度1～2 mA，连续干预4周，20 min/次，1次/2 d。假电针组大鼠针刺治疗同电针组，但是针柄不连接电针仪。假手术组与模型组在假电针组与电针组进行治疗时，均施加同等时间及强度的约束，确保外在刺激的一致性。

1.4 取材方案

末次治疗结束24 h内，采用异氟烷过量吸入麻醉后处死，解剖脊柱区，8只大鼠取下椎体组织及椎间盘组织，用于病理学检测和Micro-CT扫描，放置于足量的4%多聚甲醛固定液中，常温下保存；7只大鼠的椎间盘组织，用于检测髓核细胞的蛋白表达水平，放入-80 ℃冰箱中备用。

1.5 观察指标和检测方法

1.5.1 椎体间隙高度变化 使用Micro-CT对椎间盘组织进行扫描并重建，重建后沿正中矢状线进行断层处理，保存并导出图片。

1.5.2 病理学染色 将固定、脱钙后的椎间盘组织包埋并切片，然后常规HE染色，在光镜进行观察。

1.5.3 Western blot检测蛋白表达量 使用Western blot法检测各组大鼠腰椎间盘髓核细胞中PINK1/Parkin的蛋白表达情况。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 Micro-CT观察L3～4与L4～5椎体间隙高度变化

CT扫描完成后，将每个椎间隙均分五等份，使用ImageJ软件分别测量各组大鼠L3～4与L4～5椎间隙高度备用。通过测量发现咬除棘突及相关韧带的各组大鼠椎间隙明显减小，较假手术组差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；而通过针刺治疗后，电针组与假电针组的椎间隙高度部分恢复，较模型组差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；电针组与假电针组相比较，发现电针组椎间隙高度明显大于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

表1 各组椎间隙高度变化情况比较

2.2 腰椎间盘组织病理学染色比较

各组病理切片HE染色结果显示：假手术组髓核细胞位置居中，排布均匀，形态大而圆，纤维环排列整齐规则；模型组明显可见髓核细胞皱缩，形态各异，多似纤维条索状，纤维环排布紊乱呈椭圆形；电针组髓核细胞位置居中，排布大致均匀，形态较大、似椭圆形，纤维环排布大体正常；假电针组髓核细胞位置基本居中，排布呈中心聚集形态，周边部分呈条索状，纤维环排布基本正常，稍向侧方突起。见图2。

2.3 腰椎间盘髓核细胞中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬情况

根据蛋白检测所得的WB条带，使用ImageJ软件测得相应的灰度值。数据统计发现复制LIDD模型的各组大鼠椎间盘髓核细胞中PINK1/Parkin的表达均下调，与假手术组比较差异明显，具有统计学意义(P<0.05)；而电针组与假电针组经过治疗后，大鼠椎间盘髓核细胞中PINK1/Parkin的表达均有不同程度的上调，与模型组结果比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)；且电针组与假电针组之间比较，电针组要明显优于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3和表2。

表2 电针对LIDD大鼠椎间盘髓核组织中PINK1/Parkin蛋白水平的相对表达量

3 讨论

在椎间盘组织逐步发生退变的过程中，局部产生的微物质能够激活多种炎性介质，而引发下游炎症级联反应[11-12]，这是发生LIDD的重要病理基础。椎间盘组织主要是由中央的胶冻样髓核、包绕在周围的纤维环及上和下面贴附的软骨终板等组织构成，它相当于人体纵轴上的“缓冲器”，承接和吸收外界作用在机体的强大应力。随着年龄增长或感受异常应力后，终板软骨血供被破坏，组织营养供给减少，局部出现钙化；同时髓核细胞的含水量逐渐降低，纤维环被压缩变薄，椎间盘弹性降低，椎间隙也逐渐变窄[13-14]；影像学检查可以显示椎间盘组织表现为膨出、突出甚至脱出[15]，整个脊柱的相对稳定结构和生物力学平衡被打破，临床上就会出现腰背部肌肉紧张、疼痛及LBP等[16]一系列不适症状。

在LIDD的过程中，线粒体自噬机制起着重要的作用[17-18]。线粒体受损之后，会产生大量的线粒体DNA及活性氧等并释放到细胞质中，激活PINK1/Parkin通路的自噬信号，消除受损的线粒体[19]，这是发生LIDD疾病后机体细胞进行自我保护作用。通过siRNA敲除Parkin，促进了髓核细胞的变性和凋亡，并上调肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达，红景天苷可以上调Parkin的表达，抑制髓核细胞的凋亡，并消除线粒体受损，促进髓核细胞的存活[20]。MitoQ可以有效改善线粒体动力学平衡，清除受损的线粒体，增强核因子E2相关因子2(Nrf2)活性，增加髓核细胞的存活率[21]。Batlevi Y等[22]发现在小鼠的浦肯野细胞变性后，线粒体自噬的改变可能引起小脑中神经元细胞死亡。Zhou J等[23]在研究心肌细胞时发现，芪苈强心方通过上调Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，可降低心肌细胞的凋亡，增强其活性，改善心脏的功能。低水平的胎牛血清可以上调caspase-9、caspase-3、DNA修复酶及细胞色素c等表达，诱发细胞程序性凋亡[24]。有实验研究[25]证实，亚精胺通过激活机体的自噬反应，降低了叔丁基过氧化氢在髓核细胞中的凋亡作用，同时增加Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的合成，降低基质金属蛋白酶(MMP)和软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS)的分解；此外MRI结果显示，大鼠的椎间盘组织学变性程度降低，说明通过激活自噬，有助于改善椎间盘的功能并延缓其退变。

现代解剖学证实，夹脊穴大致位于脊神经后支，分布于背部体表及脊柱两侧深层的肌肉，多与血管伴行穿过骨纤维孔、棘肌及筋膜等组织[26]。各种因素导致各椎体之间发生挤压、移位等情况，引起通行血管、神经的孔道被迫变形变窄，诱发出现腰背部肌肉痉挛、僵直和LBP等一系列临床症状。有研究证实，电针能够有效减轻非急性疼痛患者术后的疼痛症状[27-28]。Shan YL[29]通过电针夹脊穴配伍膀胱经穴治疗腰椎间盘突出症患者，腰背疼痛症状明显减轻，治疗的有效率84.4%，优于药物组的65.0%。Arriaga-Pizano L等[30]认为电针能够诱导肾上腺素分泌，减少了TNF-α等因子的产生，能够有效缓解疼痛症状，但其作用与药物治疗无明显差异；这对于部分不适合服药的患者或是很好的替代疗法。电针配合小剂量盐酸氟西丁可以激活疼痛控制系统，改善血液流动，缓解疼痛，增强免疫系统，对躯体疼痛障碍患者疗效明显[31]。有研究[32]使用电针夹脊穴治疗以麻木为主要症状的椎间盘突出患者，通过电针规律性地收缩和舒张运动刺激局部的肌肉，使紧张的肌肉和筋膜组织得以放松，加快组织的新陈代谢和气血循行，减轻患者的不适症状。电针还能通过抑制相关炎性介质表达水平的上调[33]，并刺激神经递质的合成和释放，延缓疼痛感觉的传递，改善局部的血供，促进椎间盘组织的修复，缓解腰背部疼痛及放射痛症状[34]。

LIDD多因外伤暴力、筋伤骨折；邪气外侵或外伤失治误治；肾亏体虚、腰脊失养等引起。中医学中虽未见LIDD的命名，但在一些散见的著作条文对LIDD很早就有一定的描述及认知。《素问》曰：“解脉令人腰痛如引带，常如折腰状”“痹在于骨则重……在于筋则屈不伸”“骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”；《备急千金要方》云：“腰背痛者，皆是肾气虚弱，卧冷湿当风得之”；危亦林也提到:“针决膝腰勾画中青赤络脉，出血便瘥。腰痛不得俯仰者，令患人正立”。这些著作中的条文论述与现代医学中LIDD的临床特征基本是相同的。电针疗法是在针刺的基础上，配合特制的电针仪，加强局部针感，使针刺作用集中于局部，改善组织的微循环，以达到治疗疾病的效果。杨继洲在治疗腰痛疾患时，注重十二正经的取穴，选穴少而精，强调辨证论治在针灸学中应用的同时，侧重于针刺、灸法和药物三者的有机结合[35]，这一理论在临床应用中得到广泛认可。孙阳等[36]对32例急性腰扭伤患者以电针承山穴进行治疗，使患者腰部的自主活动逐步恢复，局部的椎小关节得以复位，放松肌肉、筋膜和韧带等软组织，使炎性物质释放减少，腰背部疼痛症状逐渐缓解；有研究结果[37]显示，电针夹脊穴可以有效减轻慢性腰痛患者的疼痛症状，还能改善患者焦虑、疲劳的状态。Heo I等[38]对54例背部术后非急性疼痛的研究证实，电针能够有效减轻非急性LBP、改善患者腰背部屈伸不利的症状。针刺通过调控炎性因子的释放、局部微环境的变化和中枢敏感度的强弱等方面[39]，达到镇痛效果，但是电针对LIDD所引起的一系列LBP等症状的治疗机制尚未有明确的论述，还需进一步探索[40]。

本实验中，通过脊柱失稳原理成功复制大鼠LIDD模型，通过对退变的椎间盘组织进行病理学染色发现，髓核细胞皱缩，形态各异，多似纤维条索状，纤维环排布杂乱无序；使用电针干预4周后，腰椎间盘髓核细胞中PINK1/Parkin蛋白水平的表达明显上调，说明通过电针夹脊穴促进了髓核细胞的线粒体自噬，抑制了髓核细胞的凋亡以及细胞外基质的分解，改善了椎间盘的局部微环境，可能有益于抑制椎间盘内炎性因子的释放，延缓LIDD的进程。此外，椎间隙高度的丢失亦是引起LIDD的原因之一，通过Micro-CT扫描并三维重建及ImageJ测量椎间隙高度变化证实，电针刺激夹脊穴能有效恢复大鼠的腰椎间盘高度，对缓解LIDD有重要的意义。本研究说明了通过电针刺激夹脊穴是改善腰椎间盘退变的可能机制，为临床治疗LIDD提供理论依据。但对电针调控线粒体自噬对上下游炎性因子的影响以及电针的剂量对线粒体自噬的影响程度大小等情况还需要进一步深入研究。