HPLC法测定维药硬尖神香草中芦丁含量

王 莹，姜君君，兰 卫，武嘉林

(1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830002；2.乌鲁木齐市第四人民医院，新疆 乌鲁木齐 830002;3.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830017；4.新疆华世丹药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011)

硬尖神香草是维吾尔医常用药材，维吾尔名为“祖帕”，为唇形科植物硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草[1]，硬尖神香草和以硬尖神香草为主药的寒喘祖帕颗粒均收载于《中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册》(WS3-BW-0195-98)[2]。研究表明，神香草具有祛痰、止咳、平喘、抗炎、镇痛等药理作用[3-5]。

作者采用高效液相色谱(HPLC)法测定硬尖神香草中芦丁含量，旨在为制定硬尖神香草质量控制标准提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

硬尖神香草，采集于新疆和田地区策勒县博斯坦乡神香草人工种植基地，经新疆医科大学中药资源教研室盛萍教授鉴定为硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草。

芦丁标准品(批号20130329)，上海源叶生物科技有限公司；乙腈(批号67-56-1)、甲醇(批号61-56-1)，色谱纯，南京化学试剂股份有限公司；磷酸(批号20150209)、乙酸(批号20160319)，天津致远化学试剂有限公司。

Agilent 1200-DAD型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；KQ-200KD型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；CBM-20A型高效液相色谱仪(LC-6AD双泵，SPD-20A紫外双波长检测器，SIL-20A自动进样器，CTO-10AS柱温箱，LC-solution色谱工作站)，日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

精密称取4.12 mg芦丁标准品，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得0.041 2 mg·mL-1芦丁标准溶液。

1.2.2 供试溶液的配制

称取硬尖神香草药材1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入10 mL甲醇，称重；用100 Hz超声波提取40 min，取出，放至常温，再用甲醇补足缺失的质量，摇匀；用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液。

1.2.3 色谱条件

Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱程序：0～9 min，13%～16%B；9～20 min,16%～32%B；20～40 min,32%～60%B；40～45 min,60%～13%B，流速1.0 mL·min-1，检测波长354 nm，进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 HPLC图谱

芦丁标准溶液和供试溶液的HPLC图谱见图1。

图1 芦丁标准溶液(a)和供试溶液(b)的HPLC图谱

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系

精密吸取芦丁标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按1.2.3色谱条件进样测定。以峰面积(y)为纵坐标、芦丁浓度(x)为横坐标绘制标准曲线(图2)，拟合得线性回归方程为：y=2055.8x+0.85,R2=0.9993。表明，芦丁浓度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图2 芦丁的标准曲线

2.2.2 精密度

精密吸取芦丁标准溶液适量，按1.2.3色谱条件连续进样测定6次。测得峰面积分别为90.5、91.2、89.6、90.1、88.3、92.1，平均峰面积为90.3，RSD值为1.45%。表明仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性

平行称取6份硬尖神香草药材各1.0 g，按1.2.2方法制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样测定。测得峰面积分别为29.5、30.2、29.4、30.7、30.7、29.7，平均峰面积为30.0，RSD值为1.95%。表明该方法的重复性良好。

2.2.4 稳定性

取供试溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h按1.2.3色谱条件进样测定。测得峰面积分别为30.3、31.0、30.3、29.8、29.3、30.6，平均峰面积为30.2，RSD值为1.98%。表明供试溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.5 加标回收率

平行称取9份硬尖神香草药材各1.0 g，均分为3组，分别加入1.78 mL(低浓度组)、3.54 mL(中浓度组)、3.72 mL(高浓度组)芦丁标准溶液，按1.2.2方法制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样测定，结果见表1。

表1 加标回收率结果

由表1可知，低浓度组的平均加标回收率为100.91%，RSD值为2.07%；中浓度组的平均加标回收率为101.60%，RSD值为1.03%；高浓度组的平均加标回收率为100.96%，RSD值为1.96%。

2.3 硬尖神香草中芦丁含量的测定

取硬尖神香草药材3份，按1.2.2方法制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样测定。测得峰面积分别为30.8、31.2、30.5，平均峰面积为30.83，计算得到硬尖神香草中芦丁含量为0.146 mg·g-1。

2.4 讨论

芦丁为黄酮类成分，具有抗氧化、抗炎症、抗病原微生物、提高免疫力等作用[6]。董元火等[7]采用HPLC法测定野生蕲艾中芦丁含量，流动相为甲醇-0.4%磷酸(55∶45，体积比，下同)，检测波长257 nm；作者发现该色谱条件下硬尖神香草中芦丁所对应位置未出峰。肖作奇等[8]采用HPLC法测定地肤子中芦丁含量，流动相为乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱；作者发现该色谱条件下硬尖神香草中芦丁出峰时间与芦丁标准品一致，但峰面积较小。齐红等[9]采用HPLC法测定白花蛇舌草中芦丁含量，流动相为甲醇-0.1%磷酸(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，检测波长353 nm；作者发现该色谱条件下硬尖神香草中芦丁出峰效果不理想。于姗姗等[10]采用HPLC法测定槐枝中芦丁含量，流动相为甲醇-1%冰醋酸(32∶68)，流速1.0 mL·min-1，柱温36 ℃，检测波长257 nm；作者发现该色谱条件下硬尖神香草中芦丁分离度不理想。作者以乙腈-0.2%磷酸为流动相，调整流动相比例，梯度洗脱，发现硬尖神香草中芦丁出峰时间与芦丁标准品一致，峰形较好，分离度>1.5，理论塔板数>3000。因此，选用乙腈-0.2%磷酸为流动相测定硬尖神香草中芦丁含量。

维药硬尖神香草的品种选择很重要，从直观判断，正宗硬尖神香草花朵正常开放是蓝紫色的，而其它品种神香草是除蓝紫色以外的其它颜色。

由于硬尖神香草与大苞荆芥外形、用法相似，故维吾尔族民间用药常以大苞荆芥充当硬尖神香草，造成药材误用，导致疗效下降。因此，制定硬尖神香草质量控制标准，为临床应用提供依据十分重要。

3 结论

首次建立了测定硬尖神香草中芦丁含量的HPLC法。色谱条件为：Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长354 nm，进样量10 μL。结果表明，芦丁浓度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；硬尖神香草中芦丁含量为0.146 mg·g-1。采用HPLC法测定硬尖神香草中芦丁含量准确可靠，为制定硬尖神香草质量控制标准提供了依据。