响应面法优化绵马贯众多酚超声辅助提取工艺及其抗氧化活性研究

侯敏娜，侯少平，何 璐，张 婵，陈佳瑶

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

绵马贯众(Dryopteriscrassirhizoma)为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨的干燥根茎和叶柄残基,始载于《神农本草经》,具有清热解毒、凉血止血、杀虫的功效[1-3]，可用于流行性感冒、癍疹、痢疾、咳血、虫积腹痛等疾病的治疗[4-11]。绵马贯众含有多酚类、黄酮类、萜类、甾类、苯丙素类、脂肪族类等[11-15]活性成分。其中多酚类化合物可淬灭单线态氧，清除体内自由基，还能络合催化氧自由基产生的金属离子，阻断自由基的产生[16]，具有较强的抗氧化活性。与正交设计法、均匀设计法相比，响应面法具有实验次数少、直观、高效、方便及在短时间全面预测实验参数等特点[17]。鉴于此，作者在单因素实验的基础上，采用响应面法优化绵马贯众多酚的超声辅助提取工艺[18]，并通过测定绵马贯众多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，评价其抗氧化活性，以期为绵马贯众资源的开发利用提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

绵马贯众，购于陕西西安万寿路药材市场，经陕西国际商贸学院中药学教研室雷国莲教授鉴定为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨的干燥根茎和叶柄残基。

没食子酸标准品(批号110831-201906)，中国食品药品检定研究院；抗坏血酸(VC)，上海源叶生物科技有限公司；DPPH(批号S18M11M109858)、ABTS(批号C10947528)，上海麦克林生物科技有限公司；福林酚，上海荔达生物科技有限公司；乙醇，成都科隆化学有限公司；无水碳酸钠，天津天力化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CP225D型电子分析天平，赛多利斯；KQ5200DE型数控超声波提取仪，昆山超声仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司；HG-9075L型立式鼓风干燥箱，北京亚太科隆技术有限公司。

1.2 绵马贯众多酚的提取

将干燥的绵马贯众药材粉碎，过40目筛，于密封塑料袋中保存。准确称取1.000 g绵马贯众粉末，按一定料液比加入一定体积分数乙醇，室温下浸泡1 h后，超声处理一定时间，过滤，收集滤液，即为绵马贯众多酚提取液。

1.3 绵马贯众多酚得率的测定

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制[17-18]

精密称取干燥的没食子酸标准品5 mg，配制成浓度为1 mg·mL-1的没食子酸标准溶液。分别移取没食子酸标准溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL试管中，加入10%福林酚试剂 1 mL，摇匀；再加入15%碳酸钠溶液 2 mL，定容至10 mL，混匀，室温反应1 h后，测定765 nm处吸光度，重复测定3次，取平均值。以没食子酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1)，拟合得线性回归方程为：y=0.828x+0.0744，R2=0.9994。表明，没食子酸浓度在0.02～0.10 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

图1 没食子酸的标准曲线

1.3.2 绵马贯众多酚得率的计算

吸取1 mL绵马贯众多酚提取液于5 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度；准确移取0.1 mL提取液稀释液，按1.3.1方法测定765 nm处吸光度，按式(1)计算绵马贯众多酚得率(Y)：

(1)

式中：c为经标准曲线计算得到的多酚浓度，mg·mL-1；V为绵马贯众多酚提取液稀释液体积，mL；n为稀释倍数；m为绵马贯众粉末质量，g。

1.4 提取工艺优化

采用单因素实验，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、乙醇体积分数(20%、30%、40%、50%、60%)、超声温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、超声时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)对绵马贯众多酚得率的影响。

在单因素实验的基础上，以绵马贯众多酚得率为评价指标，以料液比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间为自变量，根据Box-Behnken中心组合原理设计4因素3水平响应面实验，进一步优化绵马贯众多酚的超声辅助提取工艺。

1.5 抗氧化活性评价

1.5.1 对DPPH自由基清除能力的测定

精密称取2 mg DPPH粉末于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，得DPPH自由基溶液。分别配制浓度(mg·mL-1)为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0的绵马贯众多酚溶液和VC溶液各100 mL。准确移取各浓度样品溶液2 mL于10 mL比色管中，加入2 mL DPPH自由基溶液，混匀，室温下避光反应30 min，测定517 nm处吸光度，每个浓度平行测定3次，取平均值。按式(2)计算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0为2 mL DPPH自由基溶液+2 mL 无水乙醇的吸光度；A1为2 mL DPPH自由基溶液+2 mL样品溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液的吸光度。

1.5.2 对ABTS自由基清除能力的测定

参照文献[19-20]测定734 nm处吸光度，按式(3)计算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A0为2 mL ABTS自由基溶液+2 mL无水乙醇的吸光度；A1为2 mL ABTS自由基溶液+2 mL样品溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比的选择(图2)

注：乙醇体积分数50%、超声温度50 ℃、超声时间40 min

由图2可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，绵马贯众多酚得率先升高后降低，当料液比为1∶30时，多酚得率达到最高。可能是由于，当料液比为1∶30时，大部分多酚从绵马贯众中溶出，已达饱和状态，再增加提取溶剂用量，反而会引入更多杂质，使后续浓缩、分离等工序难度加大。因此，选择1∶30作为响应面实验料液比的中心点。

2.1.2 乙醇体积分数的选择(图3)

注：料液比1∶30、超声温度50 ℃、超声时间40 min

由图3可知，随着乙醇体积分数的增大，绵马贯众多酚得率先升高后降低，当乙醇体积分数为50%时，多酚得率达到最高。可能是由于，绵马贯众多酚极性与50%乙醇极性较接近，在其中溶解度较高。因此，选择50%作为响应面实验乙醇体积分数的中心点。

2.1.3 超声温度的选择(图4)

注：料液比1∶30、乙醇体积分数50%、超声时间40 min

由图4可知，随着超声温度的升高，绵马贯众多酚得率先升高后降低，当超声温度为60 ℃时，多酚得率达到最高。可能是由于，随着超声温度的升高，分子运动加快，溶出的多酚增加；但多酚的酚羟基化学性质较活泼，热稳定性较差，当超声温度过高时，多酚结构被破坏，导致多酚得率降低。因此，选择60 ℃作为响应面实验超声温度的中心点。

2.1.4 超声时间的选择(图5)

由图5可知，随着超声时间的延长，绵马贯众多酚得率先升高后降低，当超声时间为40 min时，多酚得率达到最高。可能是由于，超声时间过长，会破坏多酚的结构。因此，选择40 min作为响应面实验超声时间的中心点。

注：料液比1∶30、乙醇体积分数50%、超声温度50 ℃

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果(表1)

表1 响应面实验设计与结果

2.2.2 回归模型的建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行分析，得到多元回归方程：Y=9.24-0.096A-0.22B+0.32C-0.11D-0.14AB+0.11AC-0.92AD-0.40BC-0.15BD+0.028CD-0.80A2-0.57B2-0.94C2-0.37D2。

回归模型的方差分析见表2。

表2 方差分析

2.2.3 响应面分析

各因素交互作用对绵马贯众多酚得率影响的响应面图及等高线图如图6所示。

图6 各因素交互作用对绵马贯众多酚得率影响的响应面图和等高线图

由图6可知，料液比与乙醇体积分数的响应曲面较平缓，两者等高线近似圆形(图6a)，说明两者相互作用对绵马贯众多酚得率的影响较弱，其中乙醇体积分数的响应曲面较陡，说明乙醇体积分数的影响较为明显；料液比与超声温度的等高线近似椭圆形(图6b)，说明两者交互作用对多酚得率的影响较大，其中超声温度的响应曲面较料液比的陡，说明超声温度的影响更为显著；料液比与超声时间的等高线为椭圆形，两者的响应曲面均极陡(图6c)，说明两者交互作用对多酚得率的影响较大，这与方差分析中AD呈高度显著性的结果一致；乙醇体积分数与超声时间的响应曲面较平缓，两者等高线近似圆形(图6d)，说明两者交互作用对多酚得率的影响不明显；超声温度的响应曲面较超声时间的陡(图6e)，说明超声温度对多酚得率的影响较大，这与方差分析中C2的影响高度显著相吻合；乙醇体积分数与超声温度的等高线为椭圆形(图6f)，说明两者交互作用对多酚得率的影响显著，这与方差分析中BC呈高度显著性的结果一致，其中超声温度的响应曲面较乙醇体积分数的陡，说明超声温度对多酚得率的影响大于乙醇体积分数。

综上，绵马贯众多酚超声辅助提取工艺各参数的适宜范围为：料液比1∶(30～32)、乙醇体积分数45%～50%、超声温度60～65 ℃、超声时间35～40 min。

通过求导，确定绵马贯众多酚的最佳提取工艺为：料液比1∶31.05、乙醇体积分数47.47%、超声温度62.27 ℃、超声时间37.76 min，在此条件下，绵马贯众多酚得率的理论值为9.311%。

2.3 工艺验证

综合考虑，将绵马贯众多酚的最佳提取工艺调整为：料液比1∶31、乙醇体积分数47%、超声温度62 ℃、超声时间38 min。在此条件下进行3次平行验证实验，绵马贯众多酚得率分别为9.36%、9.22%、9.28%，平均得率为9.287%，与理论值相差0.024%。说明该提取工艺稳定、可行，可用于绵马贯众多酚的提取。

2.4 抗氧化活性

绵马贯众多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力如图7所示。

图7 绵马贯众多酚对DPPH自由基(a)、ABTS自由基(b)的清除能力

由图7可知，随着浓度的增加，绵马贯众多酚和VC对DPPH自由基、ABTS自由基的清除率均逐渐升高。当浓度为2.0 mg·mL-1时，绵马贯众多酚和VC对DPPH自由基的清除率分别为73.5%、75.3%，对ABTS自由基的清除率分别为69.8%、73.1%，无显著差异。说明绵马贯众多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力较强，且在高浓度(2.0 mg·mL-1)时清除能力接近于VC。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化绵马贯众多酚的超声辅助提取工艺，并通过测定绵马贯众多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，评价其抗氧化活性。确定绵马贯众多酚的最佳提取工艺为：料液比1∶31(g∶mL)、乙醇体积分数47%、超声温度62 ℃、超声时间38 min，在此条件下，绵马贯众多酚得率为9.287%，与理论值(9.311%)接近。绵马贯众多酚具有很强的抗氧化活性，当浓度为2.0 mg·mL-1时，绵马贯众多酚对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力接近于VC。绵马贯众多酚的抗氧化活性可能是由一种酚类或几种酚类共同发挥作用，有待进一步深入研究。