芝麻枯萎病拮抗菌的分离、鉴定及防效研究

常淑娴，马 琴，曲文文，张海洋，苗红梅，段迎辉

（河南省农业科学院 芝麻研究中心/河南省特色油料基因组学重点实验室，河南 郑州 450002）

芝麻枯萎病由尖孢镰刀菌芝麻专化型（Fusarium oxysporumf.sp.sesami，FOS）侵染引起，是芝麻生产上的重要土传真菌病害，可在芝麻全生育期产生危害，常造成植株枯萎、籽粒瘦瘪及油脂酸价上升，对芝麻产量、籽粒外观和加工品质具有较大影响[1-3]。芝麻枯萎病在非洲、亚洲、美洲等世界芝麻传统生产国均有不同程度的发生[4]，在我国该病害主要发生在东北、西北、华北、黄淮及江淮北部，常年发病率为15%左右，严重时可达30%～40%[2，5]。

研究表明，采用抗病品种结合化学、农业和生物防治措施能够对芝麻枯萎病进行持续、有效地防控。然而，受物种特性限制，对该病害表现免疫或高抗的芝麻种质资源比例较低[2，6]，这极大地影响了抗病育种工作的进展，致使生产上主推芝麻品种的枯萎病抗性表现不足。另外，我国有限的可耕种土地资源限制了轮作倒茬等农业防控措施的推广和实施。因此，使用化学农药仍是目前防治芝麻枯萎病的最主要方法。但由于尖孢镰刀菌能够以菌丝体、分生孢子和厚垣孢子在土壤中病残体上长期以腐生方式存活[5]，单一采用化学农药通常不能达到预期的防控效果[7]，且农药的大量使用会进一步造成产品农药残留、生态环境污染等问题。近年来，生物防治措施因其安全、高效、环境友好等特性受到广泛关注，相应生防菌的筛选及微生物菌剂的开发也成为作物病害生物防治的重点研究方向[8-9]。目前，利用鉴定的木霉菌、芽孢杆菌、链霉菌等多种生防真菌、细菌和放线菌防治作物枯萎病已有诸多报道[10-11]，但关于芝麻枯萎病生防菌的研究尚较少。鉴于此，通过收集来自我国不同省份的芝麻、荩草和紫花地丁根际土壤样品，系统开展芝麻枯萎病拮抗菌株的分离与筛选，鉴定获得对芝麻枯萎病具有显著防治效果的生防菌株，并明确其生物学特征，以期为开发出适于芝麻枯萎病安全高效防控的生防菌剂奠定技术和材料基础。

1 材料和方法

1.1 材料

2011－2013 年在我国河南、河北、陕西、山西、湖北、新疆6个省份（区）采集芝麻、荩草和紫花地丁根际土壤样本共33份，进行土壤微生物分离与纯化后，-70 ℃冷冻保存备用。

供试FOS 菌株HSFO 09100 和HSFO 10044[12]及我国芝麻主栽品种豫芝11 号种子均由河南省农业科学院芝麻研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 购买胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）和放线菌分离琼脂（AIA）培养基，参照说明书配制胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基；马铃薯葡萄糖蛋白胨琼脂（PDK）培养基按照配方（PDB 20 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL）配制。

1.2.2 土壤微生物分离与纯化 称取20 g 土壤样品，加入180 mL 无菌水，120 r/min 振荡搅拌30 min。将土壤悬液稀释103、104、105倍。取梯度稀释的土壤悬液分别均匀涂布于1/10 TSA、1/10 PDA（含有50 μg/mL 链霉素）和AIA 培养基平板上，分别于28 ℃条件下倒置培养1～2 d、4～5 d 和6～7 d。待细菌、真菌和放线菌菌落长出后，用无菌牙签挑取形态不同的菌落，于相应培养基表面划线分离纯化。将纯化后的细菌、真菌和放线菌菌株分别于50%、30%和30%甘油中-70 ℃冷冻保存。

1.2.3 土壤微生物拮抗作用测定 采用平板对峙培养法分析土壤微生物对FOS 菌株的拮抗作用。将FOS 菌株活化后接种于PDA 平板上培养，使用无菌打孔器打取菌饼，分别放置于PDK、PDA 和AIA培养基平板中央。同时将已分离纯化的细菌、真菌和放线菌菌株分别点种于PDK、PDA 和AIA 培养基平板上，接种点距离FOS 菌饼25 mm。28 ℃条件下培养6 d，观察并测量抑菌圈大小。

1.2.4 芝麻幼苗期拮抗菌防治效果测定 将供试FOS 菌株接种到PDB 培养基中，28 ℃、120 r/min 振荡培养3 d，收集分生孢子，加入无菌水调整孢子悬浮液浓度至1×106cfu/mL。按照2∶6∶3∶18的体积比依次加入FOS 孢子悬浮液、无菌蛭石、筛选出的拮抗细菌菌液（1×108cfu/mL）和无菌土，混合均匀后分装入营养钵中。参照仇存璞等[5]的方法对芝麻种子进行消毒和催芽，将露白的种子播种于营养钵中，每个营养钵播种9～13 枚种子。以清水拌土处理作为阴性对照，以FOS 菌株接种处理作为阳性对照，设置4个重复。播种后将营养钵放置于人工气候箱内，培养温度25～28 ℃、相对湿度60%、光/暗=15 h/9 h。处理后第18 天，依据仇存璞等[5]的芝麻枯萎病分级标准，调查各营养钵中芝麻幼苗枯萎病的发生情况，计算病情指数和生防菌的防治效果。

1.2.5 生防细菌形态特征观察及生理生化特性测试 参照东秀珠等[13]的方法对筛选出的拮抗细菌的形态特征和生理生化特性进行分析。转接细菌菌株于TSA 培养基平板上，28 ℃培养24 h，观察菌落形态。采用孔雀绿复红染色法对细菌菌株进行染色，光学显微镜下观察其有无芽孢形成。同时，利用透射电子显微镜观察细菌菌体的形态。另外，对细菌菌株进行革兰氏染色、淀粉水解、氧化酶、接触酶、柠檬酸盐和丙酸盐利用、葡萄糖发酵、蔗糖发酵、V-P、吲哚和硫化氢产生、硝酸盐还原、甲基红、精氨酸、盐耐受性（1%NaCl、3%NaCl、5%NaCl、7%NaCl、10%NaCl）等19项生理生化指标测试。

1.2.6 基于16S rDNA 序列的生防菌株分类鉴定

采用CTAB 法提取拮抗细菌的基因组DNA，利用引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）对16S rDNA 序列进行PCR 扩增。PCR 反应体系（50 μL）包括：10×PCR缓冲液5 μL、dNTP（10 mmol/L）5 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、DNA 模板1.5 μL、Taq酶（5 U/μL）0.25 μL、超纯水37.25 μL。PCR扩增程序：95 ℃3 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，30 个循环；72 ℃8 min。扩增产物经凝胶回收纯化后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序获得的16S rDNA 序列于NCBI 核酸数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST 比对，下载其同源序列，利用MEGA 5.2 软件以邻接（Neighbor-joining）法构建系统发育树，并通过Bootstrap（1 000 次）分析检验进化树各分支的置信度。

1.3 数据分析

采用Excel 2010 对试验数据进行整理，并应用SPSS 22.0 软件的Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物的分离与纯化

对取自河南、河北、陕西、山西、湖北、新疆6 个省份（区）的芝麻、荩草和紫花地丁根际土壤样品（共33份）进行微生物分离和培养，共获得微生物菌株2 146株，包括细菌1 077株（50.19%）、真菌515株（24.00%）和放线菌554株（25.81%）（表1）。

表1 33份根际土壤样品中分离获得的微生物种类及数量Tab.1 Statistics of type and number of microorganism strains isolated from 33 rhizospheric soil samples

2.2 土壤微生物对尖孢镰刀菌的拮抗作用

利用平板对峙培养法测定土壤微生物对尖孢镰刀菌的拮抗效果。在已分离的2 146 株微生物菌株中，共发现17株细菌、10株真菌和51株放线菌对尖孢镰刀菌生长具有拮抗作用（抑菌带≥0.1 cm），其中4株细菌和25株放线菌的抑菌带≥0.5 cm，以细菌菌株SF3-33和SF4-11对尖孢镰刀菌的拮抗效果最好，最大抑菌带均达到1.0 cm（图1）。

图1 细菌菌株SF3-33（a）和SF4-11（b）对尖孢镰刀菌的抑制效果Fig.1 Antagonistic activity of the isolated bacterial strains SF3-33（a）and SF4-11（b）against Fusarium oxysporum

2.3 拮抗细菌对芝麻枯萎病的防治效果

为评估细菌菌株SF3-33和SF4-11对芝麻枯萎病的防治效果，分别以强致病性FOS 菌株HSFO 09100 和HSFO 10044 对生防菌（SF3-33 和SF4-11）拌土处理进行接种，调查芝麻苗期枯萎病的发生情况。结果（表2）显示，接种HSFO 09100 和HSFO 10044 菌株第18 天，豫芝11 号幼苗病情指数分别为81.36和55.90；SF3-33菌液拌土处理豫芝11号幼苗的病情指数分别为22.60 和9.09，苗期枯萎病防治效果分别为72.22%和83.74%；SF4-11 菌液拌土处理豫芝11 号幼苗病情指数分别为30.00 和25.38，苗期枯萎病防治效果分别为63.13%和54.61%。可见，细菌菌株SF3-33 和SF4-11 对苗期芝麻枯萎病均具有显著的防治效果（P＜0.01）。

表2 细菌菌株SF3-33和SF4-11菌液处理对芝麻幼苗期枯萎病的防治效果Tab.2 Control effect of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11 on sesame Fusarium wilt at seedling stage

2.4 细菌菌株SF3-33和SF4-11的鉴定

为鉴定细菌菌株SF3-33 和SF4-11 的种属分类，对其进行了形态特征观察，并测定其生理生化特性。结果显示，SF3-33菌株菌落白色，近圆形，直径2～3 mm，表面干燥皱褶，不透明，较黏稠，易挑取（图2a、b、c）；革兰氏染色、淀粉水解、氧化酶、接触酶、柠檬酸盐和丙酸盐利用、葡萄糖发酵、蔗糖发酵、甲基红、V-P、硝酸盐还原以及耐盐性测试均显示阳性（表3）。SF4-11菌株菌落牙白色，近圆形，直径1～2 mm，表面干燥皱褶，不透明，易挑取（图2d、e、f）；革兰氏染色、淀粉水解、接触酶、柠檬酸盐利用、葡萄糖发酵、蔗糖发酵、V-P、硝酸盐还原、精氨酸及耐盐性测试均显示阳性（表3）。

图2 细菌菌株SF3-33和SF4-11的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11

表3 细菌菌株SF3-33和SF4-11的生理生化测试结果Tab.3 Physiological and biochemical indicators of the bacterial strains SF3-33 and SF4-11

进一步对细菌菌株SF3-33和SF4-11进行分子生物学鉴定。将测序获得的2 株菌株16S rDNA 序列进行BLAST 比对后，与其同源序列构建系统发育树。结果显示，菌株SF3-33 的16S rDNA 序列（GenBank 登录号：MZ227383）与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）同源性最高，序列相似性为99%（图3）；菌株SF4-11的16S rDNA序列（GenBank登录号：MZ227384）与皮奥显亚类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）同源性最高，序列相似性为99%（图4）。结合生物学特征及生理生化特性分析结果，可确定生防菌株SF3-33 和SF4-11 分别为地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和皮奥显亚类芽孢杆菌（P.peoriae）。

图3 生防细菌SF3-33的16S rDNA序列进化树Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of the biocontrol bacterial strain SF3-33

图4 生防细菌SF4-11的16S rDNA序列进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of the biocontrol bacterial strain SF4-11

3 结论与讨论

对枯萎病等土传病害的有效防控是目前作物生产中面临的主要难题。与传统化学、农业防控措施相比，生物防治具有安全、高效、环境友好等优点，近年来得到了广泛关注和深入研究，并已逐渐成为替代化学防治的有效方法。植物病害生物防治通常利用有益微生物及其代谢产物对病害的发生进行预防或控制[14]，因此，有益生物的发掘和鉴定是开发生物制剂并实施生物防治的关键。本研究从来自我国不同省份的33 份根际土壤样本中分离获得了2 146 个微生物菌株，进一步通过平板对峙培养分析，筛选出对尖孢镰刀菌具有显著拮抗作用的细菌和放线菌共29 株（抑菌带≥0.5 cm），其中细菌菌株SF3-33和SF4-11的拮抗效果最好。尽管除细菌菌株SF3-33 和SF4-11 外，尚未验证其他27 株已分离微生物对芝麻枯萎病的防治效果，但大规模拮抗微生物的筛选仍能为生防菌剂的开发提供可利用的资源材料。

目前，已被大量研究并应用的生防微生物主要为细菌、真菌、放线菌等[14-16]。其中，细菌由于种类繁多、繁殖速度快且能产生多种抗菌物质等特性，在作物真菌病害防治中具有极大的应用潜力[17-18]。早期广泛应用的放射土壤杆菌（Agrobactorium radiobact）K84 菌系能够有效预防由根瘤土壤杆菌（A.tumefaciens）引起的桃、樱桃、葡萄、玫瑰、毛白杨等植物的冠瘿病[19-20]。而利用解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）等芽孢杆菌属（Bacillus）几个种开发的生物杀菌剂，也已在世界范围内用于防治由镰刀菌、丝核菌、欧文氏菌等数十种病原菌引起的粮食、经济、园艺作物病害[21-23]。本研究基于已分离土壤微生物对尖孢镰刀菌的拮抗效果，优先选择细菌菌株SF3-33 和SF4-11 进行芝麻苗期枯萎病防效测试。结果显示，这2株细菌能够有效防治芝麻苗期枯萎病，且最大防效分别达到83.74%和63.13%，表明其在芝麻枯萎病生物防治上具有良好的应用潜力。

与本研究首次从土壤中分离获得对芝麻枯萎病具有生防作用的根际细菌不同，王俊芳等[24]从健康芝麻根系中分离得到3株可显著拮抗尖孢镰刀菌生长的内生细菌A21、G20 和G36，其对芝麻苗期枯萎病的防效分别为52%、40%和67%。根际和内生细菌均是生防细菌的重要来源。相较于内生细菌，SF3-33 和SF4-11 可能与其他根际细菌相似，更易在植物根部定殖并产生较强的拮抗作用，能够成为防御病原菌初始侵染的重要生防因子。另外，在已报道的具有生防能力的多种根际细菌中，假单孢菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）部分菌株还可作为促生菌，促进宿主植物生长，提高作物产量[25]。

SF3-33 和SF4-11 分别被鉴定为地衣芽孢杆菌和皮奥显亚类芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中应用价值较大的生防细菌，其能够通过竞争营养和生态位、产生拮抗物质、诱导寄主植物抗病性以及促进植物生长等作用有效防治多种植物病害[26]。研究发现，地衣芽孢杆菌FJAT-4能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，且可通过产生Fengycin 和Surfactin 类脂肽物质发挥其拮抗作用[27]。令利军等[28]使用地衣芽孢杆菌TG116 对黄瓜进行灌根处理，可快速诱导系统抗病性相关防御酶活性的升高，从而在一定程度上增强黄瓜对枯萎病菌的抗性。皮奥显亚类芽孢杆菌也已被报道能够用于植物病害的生物防治。BUDI等[29]发现，皮奥显亚类芽孢杆菌主要通过产生几丁质酶、蛋白酶等水解酶类抑制土传病害病原菌的生长。VON DER WEID等[30]进一步指出，皮奥显亚类芽孢杆菌不仅具有抑菌能力，而且能够有效固氮，可作为潜在的植物生防因子和生长促进剂。本研究虽已展示了细菌菌株SF3-33 和SF4-11 所具有的生防应用潜力，但目前仍不清楚这2株菌株防治芝麻枯萎病的作用机制及其在大田中对芝麻成株期枯萎病的实际防效。因此，下一步将系统分析SF3-33 和SF4-11 菌株的定殖能力、促生作用及对根际微生物的影响，并研究其产生的抑菌物质和可能存在的其他生防机制，为后续相关生防制剂的开发和大田应用奠定基础。