不同产地雪茄烟叶的风味特征和微生物群落分析

郑天飞，张倩颖，李东亮，张 娟，堵国成

（1. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2. 四川中烟工业有限责任公司技术中心，四川 成都 610000）

近年来，中国雪茄市场发展迅速，国内消费者对高端雪茄的需求旺盛[1-2]。然而，由于国内雪茄烟叶种植起步晚，原料基础研究较为薄弱，雪茄烟叶发酵技术还不成熟[3-4]，导致国产雪茄烟叶原料与国外原料在品质上存在较大差异，高端雪茄烟叶原料主要依赖国外进口[5]。

国外优质雪茄烟叶产地分布广泛，且具有不同的风格特色[6-7]。古巴的雪茄烟叶口感强劲、醇厚，带有辛辣味和多种芳香；多米尼加的雪茄烟叶以其独特的醇和烟味、轻盈的青草香气和微酸味道深受全球消费者的推崇；洪都拉斯的雪茄烟叶以浓烈、辣味和芳香闻名于世[8]。雪茄由混合烟叶卷制而成，不同的烟叶原料配比会影响整支雪茄的香味风格。因此，系统评价雪茄烟叶的风味特征对雪茄烟叶原料利用、产品开发和应用创新具有重要意义。此外，微生物在雪茄烟叶发酵过程中起着至关重要的作用[9]，不同产地的雪茄烟叶可能具有不同的微生物群落，对雪茄烟叶中的微生物群落进行研究能够为雪茄烟叶发酵指明方向[10]。近年来，基于细菌16S rRNA 基因及真菌rRNA 基因间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）的高通量测序技术已广泛应用于传统发酵微生物群落分析[11]，如叶长文等[10]采用高通量测序技术对10 个雪茄烟样品进行测序分析，发现雪茄烟样品中的优势菌门为厚壁菌门和子囊菌门，优势菌属为葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和曲霉属。不同雪茄烟叶样品中微生物群落多样性和结构存在显著差异。闫铁军等[12]通过高通量测序研究海南不同产区茄衣、茄套和茄芯的细菌群落组成，发现不同产区不同用途雪茄烟叶细菌群落多样性丰富，结构组成相似，相对丰度有所差异，葡萄球菌科、肠杆菌科是造成烟叶细菌群落结构差异的关键菌科。这些结果表明，不同地区生产的雪茄烟叶细菌群落组成可能存在较大差异。目前，关于国内外雪茄烟叶的研究已有报道[6，10]，但关注较多的是不同产地雪茄烟叶微生物群落的组成和风味差异，而微生物群落与风味之间的联系并未被探究。鉴于此，通过对国产高端雪茄常用的进口雪茄烟叶，即多米尼加、印尼和美国雪茄烟叶进行感官评吸和微生物高通量测序，分析不同产地雪茄烟叶的风味和微生物群落组成及差异，明确雪茄烟叶中的关键微生物，解析微生物群落与雪茄烟叶风味特征之间的联系，为国产雪茄工业的原料利用、产品开发和应用创新奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为目前国内雪茄工业企业的进口雪茄烟叶，主要来自多米尼加（热带雨林气候）、印尼（热带雨林气候）、美国（亚热带气候）3个国家，试验样品情况见表1，每份烟叶样品采集200～1 000 g，总共24份烟叶样品，均由四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂提供。

表1 供试雪茄烟叶信息Tab.1 Information of cigar tobacco leaves

1.2 试验方法

1.2.1 感官评价 将发酵后的雪茄烟叶去梗，回潮至含水率为（15±0.5）%；将回潮后的烟叶手工卷制成长50 mm、直径10 mm的单料烟样品待用，并对卷制样品进行基本信息标记；雪茄烟叶样品经卷制后保存在温度为18 ℃、湿度为（68±1）%的环境中平衡水分，评吸前将样品放置于室温环境中醒茄10 h 以上，供感官评吸使用。

感官评吸小组由四川中烟雪茄烟感官评吸专家组成，对试验样品的风味类型、风味强度、风味浓度进行鉴定和评分，按1—9分进行打分。评定项目主要包括雪茄烟叶的风味特征，如坚果香、豆香、木香、辛香、果香、清甜香、焦甜香、蜜甜香、正甜香、花香、熏香、药香、奶香、膏香、树脂香、窖香、烘烤香、壤香、干草、皮革香、酸香和脂粉香；雪茄烟叶的杂气，如脂粉香、蛋白质气息、土腥气、青杂气、枯焦气、金属气、花粉气、木质气；香气的醇香感，如醇和度、丰富度、成熟度；烟气的醇和感，如饱满度、流畅度、缠绵感；余味的醇净感，如甜润度、刺激性、干净度、回味感；雪茄烟叶的燃烧特性，如燃烧性、灰色、凝灰度；可感燃吸指标，如平衡感。

1.2.2 微生物群落分析 将5 g 雪茄烟叶样品与100 mL 无菌生理盐水（0.85% NaCl）加至250 mL 烧瓶中，在转速为220 r/min 的摇床中4 ℃振荡洗脱3 h，过滤烟叶碎片，7 000 ×g离心15 min 收集微生物。根据DNeasy PowerSoil 试剂盒（QIAGEN，Inc.，Venlo，Netherlands）说明书对烟叶中微生物总DNA进行抽提，并利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度。各样品3 个生物学重复，提取的DNA 样品均保存于-20 ℃以备进一步分析。

以提取的DNA 为模板，使用正向引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）对细菌和古细菌16S rRNA V4-V5 区域的基因进行扩增，使 用 通 用 引 物 ITS1F （5′-CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）扩增真菌内部转录间隔基因。PCR 反应体系（25 μL）：5 μL Q5 反应缓冲液（5×），5 μL Q5 High-Fidelity GC 缓冲液（5×），0.25 μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（5 U/μL，NEB），2 μL（2.5 mmol/L）dNTPs，1 μL 正向引 物（10 μmol/L），1 μL 反 向 引 物（10 μmol/L），2 μL DNA 模板和8.75 μL无核酸酶水。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，28 个循环（98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最终72 ℃延伸5 min。 使 用 Agencourt AMPure Beads（ 美 国Beckman Coulter 公司）纯化扩增的PCR 产物，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit（美国Invitrogen 公司）进行定量，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（美国Illumina 公司）制备测序文库。使用MiSeq 测序仪和MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）进行2×300 bp的双端测序。

使用QIIME 2对原始序列进行处理。先对原始序列（Reads）进行低质量部分剪切，再根据Barcode从得到的Reads 中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据（Raw reads）。经过以上处理后得到的Reads 序列通过UCHIME Algorithm 与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。对有效数据在99%水平上聚集成扩增子序列变体（ASV），使用q2-feature-classifier QIIME 2 插件执行分类学分类。

1.3 数据处理与统计分析

采用Excel 2019 对试验数据进行整理，采用SPSS 22.0、Origin 8.0分别对试验数据进行差异显著性分析、图表制作，使用Galaxy（https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）进行LEfSe 分析，评估不同产地雪茄烟叶的差异显著性。并通过Spearman 相关系数（P＜0.05，|r|＞0.3）建立代表性微生物和雪茄烟叶风味特征之间的相关性，使用Gephi 软件进行网络可视化。

2 结果与分析

2.1 不同产地雪茄烟叶的风味特征分析

雪茄烟叶样品的风味、杂气和整体质量得分如图1 所示。风味中坚果香、木香、焦甜香和烘烤香，得分最高（4 分），其他香味大多得分在2～3 分；杂气方面，蛋白质气息、青杂气和枯焦气问题较为显著，得分最高为3分；烟叶整体质量方面，醇和度得分最高，其他大多得分在4～7分，不同烟叶间差异较小。

图1 不同产地雪茄烟叶样品评吸得分Fig.1 Evaluation score of cigar tobacco leaves from different producing areas

对雪茄烟叶感官评吸数据进行主成分分析，结果如图2 所示。印尼雪茄烟叶样品YBQ、YCQ 和YM1Q 因具有较高的蛋白质气息、青杂气和枯焦气而聚类在一起，烟叶样品YBH、YCH 和YM1H 具有较高的蜜甜香和酸香。多米尼加的雪茄烟叶样品香气最为丰富，具有坚果香、豆香、木香、焦甜香、烘烤香、焦甜香和甘草香等风味，且烟叶整体质量较好。美国雪茄烟叶样品风味和杂气均不突出。印尼雪茄烟叶样品的风味与多米尼加雪茄烟叶样品有一定的差异，而且有些烟叶样品具有较为严重的杂气。

图2 不同产地雪茄烟叶样品评吸得分的主成分分析Fig.2 PCA plot marked by sensory analysis score of cigar tobacco leaves from different producing areas

2.2 不同产地雪茄烟叶的微生物群落分析

2.2.1 微生物群落组成 对24 个雪茄烟样品中的微生物进行Illumina MiSeq 高通量测序，分别得到2 504 129条和3 701 781条高质量的16S rRNA 序列和ITS 序列，平均每个样品分别高达34 779 条和51 413 条。对这些序列进行分类鉴定，如图3 所示，细菌中优势的门为Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria（图3A），优势的属为Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas（图3B）。真菌中优势的门为Ascomycota 和Basidiomycota（图3C），优势的属为Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria（图3D）。不同产地雪茄烟叶中微生物相对丰度具有显著差异。其中，差异最显著的是细菌中的优势门Proteobacteria 和Firmicutes，在多米尼加雪茄烟叶样品中相对丰度分别为13.87%和67.74%，在美国雪茄烟叶样品中相对丰度分别为35.92%和50.22%，在印尼雪茄烟叶样品中相对丰度分别为78.54%和6.80%；差异最显著的属是Staphylococcus和Pseudomonas，在多米尼加雪茄烟叶样品中相对丰度分别为55.61%和2.41%，在美国雪茄烟叶样品中相对丰度分别为35.90%和6.61%，在印尼雪茄烟叶样品中相对丰度分别为1.88%和26.52%。不同地区雪茄烟叶样品中真菌群落的差异小于细菌。

图3 不同产地雪茄烟叶样品中主要细菌门（A）和属（B）以及主要真菌门（C）和属（D）的相对丰度Fig.3 Relative abundance of predominant bacterial phyla（A）and genera（B），predominant fungal phyla（C）and genera（D）in cigar tobacco leaves from different producing areas

2.2.2 微生物群落多样性 采用基于Chao1指数的α-多样性衡量不同产地雪茄烟叶样品中微生物群落的丰富度，采用基于bray_curtis 距离矩阵的β-多样性衡量不同产地雪茄烟叶样品中微生物群落物种组成的差异性。不同产地雪茄烟叶中微生物群落多样性分析如图4 所示。由图4 可知，不同产地雪茄烟叶中微生物群落α-多样性具有显著差异，美国和印尼的雪茄烟叶中细菌群落的丰富度显著高于多米尼加，而多米尼加的雪茄烟叶中真菌群落的丰富度显著高于美国。不同产地雪茄烟叶样品中微生物群落的物种组成也有一定差异，细菌群落因地域原因在横坐标上造成36.9%的差异，真菌群落因地域原因在横坐标上造成20.4%的差异，真菌因地域造成的差异小于细菌。

图4 不同产地雪茄烟叶样品中微生物群落的多样性Fig.4 Diversity of microbial communities in cigar tobacco leaves from different producing areas

通过韦恩图统计不同产地雪茄烟叶微生物群落中的相同物种数目，如图5 所示，3 个产地共有细菌有280 种，共有真菌仅有84 种。其中，多米尼加与印尼有较多相似的细菌和真菌物种。

图5 不同产地雪茄烟叶样品中独特和共有的细菌（a）和真菌（b）微生物群数量Fig.5 Numbers of unique and shared bacterial（a）and fungal（b）microbiota in cigar tobacco leaves from different producing areas

通过LEfSe 分析不同产地雪茄烟叶微生物群落中门水平以下的特异性物种，如图6所示，细菌中的差异物种包括6 个门，10 个纲，21 个目，29 个科，34个属；真菌中的差异物种包括6 个门，12 个纲，19 个目，26 个科，37 个属。印尼的雪茄烟叶有较多特异性细菌，多米尼加的雪茄烟叶有较多特异性真菌。

图6 不同产地雪茄烟叶样品中具有显著差异的细菌（a）和真菌（b）进化分支图Fig.6 Evolutionary branch map of bacteria（a）and fungi（b）with significant difference in cigar tobacco leaves from different producing areas

为了更好地区分不同产地的雪茄烟叶，进一步分析烟草微生物群成员是否可以如其他性状（如风味、叶色和基因组特征）一样用于区分雪茄烟叶的产地。通过随机森林模型在属水平上筛选一些微生物来区分不同产地的雪茄烟叶，结果如图7所示，20 个细菌属如Methylobacterium、Yaniella、Bacillus、Faecalibacterium、Tetragenococcus等和20 个真菌属如Wallemia、Pichia、Thermoascus、Penicillium、Fusarium、Alternaria等在区分不同产地雪茄烟叶方面具有显著的重要性。

图7 用于区分不同产地雪茄烟叶的重要性排名前20的细菌属（a）和真菌属（b）Fig.7 Top 20 genera of bacterial（a）and fungal（b）communities used for discriminating tobacco leaves from different regions

2.3 雪茄烟叶风味特征与微生物群落之间的关系

用Spearman 相关系数分析风味特征和微生物（相对丰度排名前30的细菌和真菌）之间的联系，并用Gephi 可视化。如图8 所示，雪茄烟叶的风味与细菌群落具有密切的相关性，如坚果香、豆香、木香、辛香、果香、焦甜香、花香、熏香、膏香、烘烤香、干草香和皮革香与Staphylococcus、Corynebacterium_1、Tetragenococcus和Atopostipes具有显著的正相关性，清甜香和蜜甜香与Pseudomonas、Ralstonia、Pantoea、Brevibacterium、Methylobacterium、Bacillus、Stenotrophomonas和Ochrobactrum具有显著的正相关性。雪茄烟叶的风味特征与真菌群落的关联较与细菌的关联少，但坚果香、豆香、辛香、果香、焦甜香、花香、熏香、膏香、窖香、干草香和皮革香也与许多真菌呈正相关。烟叶中的杂气，如蛋白质气息、青杂气和枯焦气与Sphingomonas具有正相关，与Atopostipes具有负相关。

图8 雪茄烟叶微生物群落与风味特征的相关性Fig.8 The correlation between flavor characteristics and microbial community of cigar tobacco leaves

3 结论与讨论

本研究对多米尼加、美国和印尼3 个产区的雪茄烟叶进行感官评吸，并通过高通量测序技术分析其表面微生物，以揭示不同产地雪茄烟叶的风味、品质、表面菌群特征差异以及微生物群落与风味特征之间的联系。

感官评吸结果表明，多米尼加的雪茄烟叶香气最为丰富，杂气较少，且烟叶整体质量较好。美国和印尼的雪茄烟叶香气较少，且有些杂气，这与李秀妮等[6]对全球主要雪茄产地雪茄烟叶风味特征的初探结果一致。微生物群落分析发现，本研究中雪茄烟叶的优势菌门如Firmicutes、Proteobacteria 和Actinobacteria，也在其他烟草微生物群落研究中出现，它们在烟草发酵过程中充当分解者，将大分子（纤维素、果胶和淀粉）降解为小分子（葡萄糖、果糖和 麦 芽 糖）[13]；优 势 菌 属 如Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas在其他研究中也有报道。葡萄球菌（Staphylococcus）参与脂肪代谢，产生的脂肪酸会进一步降解形成醛和酮类等芳香类物质[14]。 之前的研究发现，鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）也是雪茄烟叶中醛和酮的主要产生者[15]。假单胞菌（Pseudomonas）可以降解烟碱，影响雪茄烟叶吸食劲头[16]。以往对雪茄烟叶中真菌群落的研究较少，本研究中，雪茄烟叶真菌优势属有Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria，其在推动养分循环、调节植物矿质营养和缓解烟叶养分限制方面也发挥着重要的生态作用[17]。

此外，本结果表明，不同产地雪茄烟叶细菌群落具有较大差异，不仅一些优势细菌的相对丰度差异较大，而且整体群落结构也有很大差异。雪茄烟叶上的微生物群落主要来自田间生长时的土壤和周围环境，以及干燥时的空气。环境中微生物群落也影响烟叶上的微生物群落[18]。空间是造成不同产地烟叶细菌群落差异的一个重要因素[19]。另外，烟叶原材料、发酵工艺和发酵过程参数调控也会极大地影响雪茄烟叶中的细菌群落[20-22]。然而，与细菌群落相比，真菌群落中没有发现相同的趋势，不同地区雪茄烟叶中真菌群落差异较小，故认为雪茄烟叶中的真菌群落不呈区域性变化。

不同产地的雪茄烟叶也有一些共同成员，尽管数量相对较少。这些共有成员可能与大分子物质的降解有关，但它们也可能是有害物质的生产者，因为有害物质（如亚硝胺和焦油等）基本上存在于所有烟草产品中。相反，不同产地的特异性微生物群落可能是不同产地雪茄烟叶特殊香气的创造者。此外，本研究发现一些微生物类群可以用来区分不同产地的雪茄烟叶。通过关联网络分析发现，与真菌群落相比，细菌群落与雪茄烟叶风味特征之间的联系更加密切，Staphylococcus、Corynebacterium_1、Tetragenococcus和Atopostipes等对雪茄烟叶的风味形成具有重要的贡献。

本研究通过对不同产地雪茄烟叶的风味和微生物群落进行研究，揭示了雪茄烟叶中微生物群落与烟叶品质之间的联系。结果表明，多米尼加的雪茄烟叶风味特征最为突出，香气最为丰富；雪茄烟叶中优势细菌属为Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas，优 势 真 菌 属 为Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria；不同产地雪茄烟叶中细菌群落相较于真菌群落具有更大的差异，且细菌群落与风味特征之间的联系更加密切，对雪茄烟叶的风味形成具有重要的贡献。这些结果将会促进我国雪茄烟叶原料利用、产品开发和应用创新，为从优质进口雪茄烟叶中筛选功能菌株用于国产雪茄烟叶发酵，改善雪茄烟叶的风味和质量，减少有害物质奠定基础。