油菜素内酯对烟草幼苗根系构型的影响及调控机制

梁 栋，刘光亮，石 屹，王树声，王程栋，王晓琳

（1. 三门峡市烟草公司卢氏县分公司，河南 卢氏 472200；2. 中国农业科学院 烟草研究所/农业农村部烟草生物学与加工重点实验室，山东 青岛 266101）

油菜素内酯（BRs）参与调控植物一系列生长发育过程，如胚根和胚轴的伸长、叶片伸展、开花和结果、细胞程序性死亡等，其中最典型的作用就是调控细胞的伸长和分裂[1-2]，且参与植物抵御非生物胁迫过程[3-4]。BRs作用于根系时调控根细胞伸长和根系发育，如根毛形成、侧根起始、根细胞分裂和根分生组织原生韧皮部的分化[5-6]。以往研究表明，BRs可以促进烟草种子萌发，增强烟株抗逆性[7-9]，提高烟草植株的根系活力，促进烟株体内碳氮代谢[10-12]，因而BRs 能够通过改善根系状态提高烟叶品质。然而，BRs 如何调控烟草根系发育的相关研究报道还较少。

栽培烟草没有明显的主根系，生育前期根系的总根长和侧根数目对烟草后期的生长影响很大，直接关系到烟叶产量的稳定和品质的提高[13]，因而，研究BRs 如何调控烟草前期侧根生长具有重要的生产和实践意义。在小麦中的研究表明，BRs 可以通过调控生长素分布进而影响侧根的生长发育[6]。因而推测BRs 可能通过生长素调控烟草侧根发育，进而影响根系功能。外源添加植物激素是研究激素作用的一种常用方法[14]，为验证这一假设，采用人工合成的油菜素内酯类似物2，4-表油菜素内酯（2，4-epibrassinolide，EBR）和油菜素内酯合成抑制剂BRZ，通过水培的方法，检测烟草幼苗根系表型以及生长素的变化，以期解析BRs 在烟草根系发育中的调控功能，为BRs在烟草中的应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料与试验设计

试验于2019—2020 年在中国农业科学院烟草研究所温室[（25±0.5）℃，湿度40%～60%，光暗周期为16 h∶8 h）]进行。供试材料为烟草品种农大202和烟草转基因DR5::GUS材料，均由国家农作物种质资源平台烟草种质资源子平台（中国农业科学院烟草研究所）提供。

将供试烟草材料的种子消毒后播种到基质（泥炭和蛭石比例为1∶1）中，发芽1 周后选取长势一致的幼苗，移栽于含营养液（营养液均为1/4 霍格兰营养液，pH 值为5.5）的周转箱（3 L）中生长，发育至二叶一心时，挑选9 株长势一致的幼苗继续培养在含营养液的周转箱（3 L）中，缓苗2 d 后移至含营养液的周转箱（3 L）中进行处理：CK（不添加EBR 和BRZ）、EBR 处理（0.1、0.5、1、5、10、100 nmol/L EBR）和BRZ处理（100、500 nmol/L BRZ），处理时间为9：00。

EBR（上海麦克林公司）用无水乙醇配成10 mmol/L 的母液，根据需要按一定的比例用1/4 霍格兰营养液稀释配成不同浓度的EBR 处理使用液；BRZ（上海阿拉丁公司）用DMSO 配制成0.1 mol/L 的母液，再配制成浓度为100 nmol/L 和500 nmol/L 的BRZ 处理使用液。试验重复3 次，且温室生长条件均一致。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 根系数量性状测定 对处理3 d 后的农大202 根系进行取样，采用LA1600+根系扫描仪成像，测定总根长和根系平均直径。采用计数法测定一级侧根数量，并用刻度尺测量其长度。一级侧根均长即为一级侧根总长度除以一级侧根数，二级侧根密度为每条一级侧根上的二级侧根数除以一级侧根长度。

1.2.2 根尖横截面显微观察 在处理3 d 后的农大202 二级侧根根尖距最下端1 cm 处进行取样，每个处理取8株幼苗，参照陆彦等[15]的方法用扫描电子显微镜VEGA3（TESCAN）进行根尖横截面显微观察。

1.2.3 根系GUS（β-葡萄糖苷酸酶）组织表达分析 将处理3 d 后的烟草转基因DR5::GUS材料的根系置于装有GUS染液的离心管中，恒温37 ℃染色2 h，然后在SZX2-ILLK 体视镜下观察，再用LEICADC100（Olympus，Tokyo，Japan）拍照。

1.2.4 根系生长素（IAA）含量测定 剪取处理3 d后的烟草转基因DR5∶∶GUS材料侧根置于液氮保存，参照龚晓崇等[16]的方法，用安捷伦（Agilent）1290高效液相色谱仪串联AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪测定烟草侧根中内源性激素IAA含量。

1.2.5 烟草根系生长素运输基因表达分析 在NCBI 上搜索烟草生长素运输基因Nt PIN1S（KC347302.1）、Nt PIN1T（KC460399.1）、Nt PIN3aT（KC425459.1）、Nt PIN3bS（KC438370.1）、Nt PIN3bT（KC433529.1）和Nt PIN11T（KC433528.1）以及烟草内参基因Nt L25（L18908.1）[17]。由于Nt PIN基因家族彼此间相似性太高，不能直接设计出引物，故首先选择差异比较大的位点，然后再用Primer 5 软件设计引物，最后再进行实时荧光定量PCR 验证。表1 为最终设计的引物序列。对处理9、24、48 h 后的烟草侧根进行取样。

表1 实时荧光定量PCR 引物Tab.1 The list of real-time PCR primers

1.3 数据处理

试验数据用WPS Office 2018 进行整理、分析和作图，并用SAS 9.4（中文版）进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EBR及BRZ处理对烟草根系构型的影响

不同浓度EBR 处理后，烟草总根长、一级侧根数、一级侧根均长、二级侧根密度和根系平均直径均呈现差异。与CK 相比，低浓度（0.1 nmol/L）EBR会使烟草总根长显著增加，增幅达到了29.0%；高浓度EBR（≥1 nmol/L）处理后烟草总根长显著降低，1、5、10、100 nmol/L EBR 处 理 下 分 别 降 低14.5%、17.3%、22.3%、35.2%（表2）；极高浓度（100 nmol/L）EBR 处理导致一级侧根数显著降低（P＜0.05），其他处理间并无显著差异。低浓度（0.1 nmol/L）EBR 处理，一级侧根均长显著升高，但当处理浓度升高到0.5 nmol/L 后，一级侧根均长开始显著降低，在0.5、1、5、10、100 nmol/L EBR 处理下，一级侧根均长较CK 分别降低4.6%、9.6%、18.5%、29.6%、36.9%。EBR 浓度在0.1～10 nmol/L 时，二级侧根密度不断增加，与CK（1.74 条/cm）相比，从1.81 条/cm 上升到2.67 条/cm，而在100 nmol/L EBR 处理下显著降低，与CK 差异不显著。根系平均直径随着EBR 浓度增大而降低，当EBR 浓度达到100 nmol/L 时，根系平均直径较CK下降21.7%（表2）。

表2 不同浓度EBR和BRZ处理对烟草根系构型的影响Tab.2 Effects of different concentrations of EBR and BRZ on root phenotypes of tobacco

CK 以及100、500 nmol/L BRZ 处理下，烟草总根长、一级侧根数和二级侧根密度无显著差异。500 nmol/L BRZ 处理下，一级侧根均长较CK 显著下降，而100、500 nmol/L BRZ 处理下，根系平均直径较CK均显著增加（P＜0.05），分别增加27.5%、24.6%。

观察不同EBR 和BRZ 处理下根系构型变化发现，当EBR 浓度为10 nmol/L 时，烟草二级侧根密度增幅最大，当BRZ浓度为100、500 nmol/L时，根系平均直径显著增大，因此，以下选取CK、10 nmol/L EBR、500 nmol/L BRZ 3个处理做进一步分析。

2.2 EBR及BRZ处理后烟草二级侧根扫描电镜观察结果

图1 表明，与CK 相比，EBR 处理下烟草二级侧根直径减小，而BRZ 处理下烟草二级侧根直径增加；10 nmol/L EBR 处理下根中细胞总数目减少，而500 nmol/L BRZ处理下根中细胞总数目增加。

图1 烟草幼苗二级侧根根尖的横切扫描电子显微镜图像Fig.1 Transverse scanning electron microscope images of the root tips of secondary lateral roots of tobacco seedlings

进一步分析表明，10 nmol/L EBR 处理下烟草二级侧根横切直径为125.62 μm，较CK 显著减少32.5%；中 柱 直 径 为33.77 μm，较CK 显 著 减 小25.0%。而500 nmol/L BRZ 处理下烟草二级侧根横切直径为220.14 μm，较CK 显著增加了18.3%；中柱直径达到57.43 μm，较CK显著增加27.5%（表3）。

表3 EBR和BRZ处理对烟草二级侧根直径的影响Tab.3 Effects of EBR and BRZ treatments on thediameter of tobacco secondary lateral roots

综上结果可知，BRs 处理能够使烟草二级侧根细胞数目、横切直径和中柱直径发生显著变化，从而引起烟草二级侧根直径发生变化。

2.3 EBR及BRZ处理对烟草侧根生长素空间分布的影响

采用烟草转基因DR5::GUS材料可以反映生长素的空间分布[18]。GUS 染色结果（图2）显示，与CK相比，10 nmol/L EBR 处理烟草侧根原基、二级侧根和根尖上均出现明显的深蓝色，表明DR5::GUS表达水平明显升高，这些部位生长素含量高；而500 nmol/L BRZ 处理侧根原基上蓝色小点明显增多，二级侧根变深，表明这些部位DR5::GUS表达水平明显升高，生长素含量高，而根尖与CK 相比无明显差别。

图2 烟草侧根GUS染色结果（比例尺为1 mm）Fig.2 GUS staining results of lateral roots of tobacco（Bar=1 mm）

2.4 EBR及BRZ处理对烟草侧根生长素含量的影响

为了探究是否是因为生长素含量变化导致DR5::GUS表达水平升高，在处理3 d 后检测烟草根系的IAA 含量。与CK 相比，10 nmol/L EBR 处理下烟草IAA 含量显著下降7.1%，而500 nmol/L BRZ 处理后IAA含量与CK无显著差异（图3）。

图3 EBR和BRZ对根中IAA含量的影响Fig.3 The effect of EBR and BRZ on the content of IAA in roots

2.5 EBR及BRZ处理后烟草根系生长素转运Nt PIN家族基因表达差异

从图4 可以看出，10 nmol/L EBR 处理后，烟草根系生长素转运基因家族中PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T表达水平明显上调，而PIN1S和PIN1T表达水平变化不显著。从图5 可以看出，500 nmol/L BRZ 处理下运输基因家族中PIN1S、PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T的表达水平均有不同程度上调，其中PIN3bS表达水平上调最为显著。这表明EBR 和BRZ 处理均会影响生长素转运基因的表达，进而影响生长素在侧根中的分布，最终反馈到根系的生长上。

图4 10 nmol/L EBR处理9、24、48 h后烟草根系Nt P1N家族基因相对表达量Fig.4 Relative expression of Nt PIN family genes in tobacco roots after 10 nmol/L EBR treatment for 9 h，24 h and 48 h

图5 500 nmol/L BRZ处理9、24、48 h后烟草根系Nt P1N家族基因相对表达量Fig.5 Relative expression of Nt P1N family genes in tobacco roots after 500 nmol/L BRZ treatment for 9 h，24 h and 48 h

3 结论与讨论

根系是植物吸收水分和养分的结构基础，其形态结构会随着环境而变化。本研究发现，低浓度BRs 显著增加了烟草幼苗总根长，而高浓度BRs 抑制根系伸长，促进根生长的最适BRs 浓度为0.1 nmol/L。超过该浓度时，根伸长受抑制，同时会造成根系形态异常和出现不对称发育，这与BRs 在其他作物中的研究报道基本一致[19-20]。根部可将外源EBR 运输到地上部[21]，本试验结果表明，高浓度（＞1 nmol/L）EBR 会导致烟草叶柄伸长、烟叶卷曲，显著降低总根长，而BRZ 对烟草总根长无明显影响；极高浓度（100 nmol/L）EBR 显著抑制烟草一级侧根数，其他浓度EBR 对烟草一级侧根数无显著影响，而不同浓度BRZ 对于一级侧根数均没有明显影响；随EBR 浓度的增加，烟草二级侧根密度显著增加，但当浓度为100 nmol/L 时，与CK 相比无显著差异，这与在拟南芥上的报道一致[22]；根系平均直径随着EBR 浓度增大而降低，当EBR 浓度达到100 nmol/L 时，平均直径较CK 下降21.7%，而在100 nmol/L 和500 nmol/L BRZ 处理下，根系平均直径分别增加27.5%和24.6%。

分生区细胞的分裂和伸长区细胞的扩张是植物根系伸长的主要驱动力[23]，本研究用扫描电子显微镜观察了烟草二级侧根横截面，发现10 nmol/L EBR 处理下侧根直径减小，细胞总数目减少，而500 nmol/L BRZ 处理下侧根直径增加，细胞总数目明显增多；EBR 处理下二级侧根横切直径减少32.5%，中柱直径减小25.0%，而BRZ 处理二级侧根横切直径增加18.3%，中柱直径增大27.5%。说明BRs在烟草根径细胞平周分裂过程中发挥重要的功能。EBR会影响根细胞的生长发育，这与侯立江[24]在小麦幼苗侧根中的研究结果基本一致。

生长素的局部积累和再分配在植物器官形成过程中至关重要[25-27]。植物通过调控生长素的极性运输调控侧根的生长发育[28]。合成启动子DR5对生长素敏感，且呈剂量依赖性[29]，其活性反映了某些组织尤其是根中内源性生长素的水平[17]。本研究对烟草转基因DR5::GUS材料进行染色发现，与CK 相比，10 nmol/LEBR 处理下烟草侧根原基、二级侧根和根尖均呈现出更加明显的深蓝色，表明DR5::GUS表达水平显著升高，说明EBR 可以调控根中不同部位生长素的水平，进而促进二级侧根密度增加。有研究表明，BRs 可能通过正向调控一种丝氨酸羧肽酶BRS1 使植物侧根原基更容易突破根皮层，侧根原基生长速率增快，从而使植物的二级侧根数显著增加[30]，而500 nmol/L BRZ 处理后，烟草侧根原基和二级侧根上的蓝色也明显加深，但是二级侧根密度并未增加。这表明EBR 能够显著促进侧根原基突破表皮形成侧根，而外源BRZ 不能促进侧根原基突破表皮形成二级侧根，这与张爱华[31]在小麦中的研究一致。通过对根中IAA 含量进行检测发现，10 nmol/LEBR 处理后IAA 含量并未增加，甚至有所降低，这表明EBR 处理使DR5::GUS表达量升高是因为EBR 调控了根中生长素的分布，而非生长素含量升高。

生长素极性运输依赖于内输载体AUX/LAX 家族、外输载体PIN 蛋白家族和ABCB/PGP 蛋白家族[32]。其中，PIN1介导生长素向根尖的运输[33]。PIN3基因主要参与植物的向性生长[34]、促进生长素在根两侧的不对称运输，使根产生向重力弯曲[35]。通过对烟草根系中生长素运输基因表达量进行分析可知，10 nmol/L EBR 处理生长素转运基因家族中PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T起重要作用，而500 nmol/L BRZ 处理生长素转运基因家族中PIN1S、PIN3aT、PIN3bS、PIN3bT和PIN11T起重要作用，表明EBR 和BRZ 均会使Nt PIN家族基因上调，从而调控根中生长素的分布，形成更多的侧根原基，与本研究中GUS 染色结果相一致。但是EBR能够显著促进侧根原基突破表皮形成侧根，而外源BRZ 不能促进侧根原基突破表皮形成二级侧根，这是表型差异的原因。

本研究通过油菜素内酯类似物EBR 及抑制剂BRZ 研究了油菜素内酯对烟草根长、根系直径与侧根数量的影响，并且通过激素及基因表达研究探讨了油菜素内酯影响根系构型的可能机制。低浓度EBR（0.1 nmol/L）处理使烟草总根长增加，EBR＞0.5 nmol/L 时对根系伸长有显著抑制作用；EBR 和BRZ主要通过调控根层细胞的大小和数目来影响烟草幼苗二级侧根的发育，EBR会降低其平均直径，BRZ促进二级侧根直径增大。侧根原基、二级侧根和根尖中DR5::GUS表达水平及生长素极性运输蛋白Nt PINS基因家族有关基因表达量的研究表明，油菜素内酯通过影响生长素在根中的分布调控二级侧根发育，而不是影响生长素的总含量。以上研究结果为烟草幼苗侧根构型的激素调控及培育优质烟苗提供了理论支持。