盐酸小檗碱与左氧氟沙星联合抑制MRSA及其机制研究

操庆国，郭 钦，彭 凯，蔡佳惠，任成万，李昀庭

(1.江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院，句容 212400； 2.江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)是一种高度且多重耐药的食源性致病菌，已被列为3大世界最难解决的感染性疾患之一。MRSA基因组中含有葡萄球菌染色体盒，后者携带基因，其编码新的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)PBP2a，具有转糖基酶和转肽酶活力，通过催化转肽反应合成肽聚糖。PBPs是细菌细胞膜上能与β-内酰胺类抗生素结合的蛋白质，MRSA中包含6种PBPs(PBP1、PBP2、PBP3、PBP3’、PBP4和独特的PBP2a)。PBP2a和β-内酰胺类抗生素几乎没有亲和力，当其他PBPs与β-内酰胺类抗生素结合失去活性后，PBP2a仍可继续参与肽聚糖合成，因此MRSA对几乎所有β-内酰胺类抗生素均耐药。此外，、和等基因也对MRSA的耐药性起重要作用。MRSA是导致化脓性关节炎、皮肤和软组织感染、肺炎、脑膜炎和心内膜炎等严重感染的主要细菌病原体之一。MRSA分泌的肠毒素热稳定性较好，100 ℃处理30 min后仍保持活性，是高温灭菌后引起食物MRSA中毒的主要原因。

MRSA可通过食物链传播，近年来，世界范围内从肉类到乳制品等多种食品中都发现了MRSA。易受MRSA污染的食物包括发酵制品、乳制品和肉鱼类制品等。Jones等在2002年首次报道了由社区获得性MRSA引起的食物中毒。检测美国5个城市的136份肉类样品发现， 42%的猪肉感染了葡萄球菌(SA)，其中，64%为MRSA感染。在瑞士和日本的肉类产品中，SA的检出率分别为23%和65%。食用被MRSA污染的食物，极易引起呕吐、腹泻、肠胃炎等，严重时会引起食物中毒，甚至危及生命。MRSA对食品安全构成了巨大威胁，占北美细菌性食物中毒的9.52%，每年约造成1.5亿美元的经济损失。

目前，MRSA已发生转移，通过环境、畜牧业、食物链等进入人体，对人类健康造成严重威胁。2005年，首次证实猪源MRSA可通过猪传给人群。Boer等在264/2217份样本中发现MRSA(11.9%)，Neeling等在荷兰9个屠宰场中抽取的209/540头猪鼻腔中有MRSA，每个屠宰场中均有生猪被检出带有MRSA。由于MRSA对四环素类、林可胺类、氨基糖苷类、大环内酯类和氟喹诺酮类等多种抗菌药物也有耐药性，使防治MRSA引起的牲畜感染非常困难，高效、安全的动物源MRSA新型抗菌药物急需开发。

新型抗生素研发一般需要10～15年，而细菌耐药性产生仅需要2～3年，因此天然产物与抗生素联合抑菌被视作防治MRSA的研究热点之一。已发现的PBP2a天然产物抑制剂包括黄芩中的黄芩苷、绿茶中的儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCg)、大角莲中的柯里拉京和玫瑰中的鞣质和特里马素等。此外，小舌菊和四环素联用、黄连叶精油或姜花素D或刺苞菊醛和庆大霉素联用、鼠尾草酸和诺氟沙星等的联用皆能协同降低抗生素对MRSA的MIC，但协同抑菌机制并未得到清晰的阐明。本研究从多种天然产物中进行抗MRSA筛选，并与抗生素进行联合抑菌试验，同时阐释天然产物与抗生素联合抑制MRSA的分子机制，为降低畜牧养殖中抗生素的使用、提高肉奶类食品安全奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)购自武汉大学菌种保藏中心，MRSA(ATCC 33591)购自美国模式菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)，盐酸小檗碱(BBR)购自西安优硕生物科技有限公司，阿莫西林、左氧氟沙星、万古霉素、氯霉素、头孢唑林、青霉素、四环素均购自上海原叶生物有限公司；RNAprep Pure提取试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 逆转录试剂盒、SYBRR Premix Ex TaqTM‖PCR试剂盒购自北京宝日医生物有限公司(TaKaRa)，牛肉浸粉购自青岛海博生物技术有限公司，其他试剂均为分析纯，购自上海国药集团。

超净工作台购自苏净化设备有限公司，LRH系列生化培养箱购自一恒科学仪器有限公司，高压灭菌锅购自鸟取三洋电机，HYG-C型多功能摇床购自太仓试验设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)检测

1.2.1.1 天然产物配制：称取BBR 0.1 g，振荡后均匀溶解于1 mL水中，浓度为 0.1 g·mL，过滤除菌后，4 ℃保存。

1.2.1.2 抗生素配制：称取7种抗生素0.012 8 g，溶解于1 mL无菌水中，浓度为12.8 mg·mL，过滤除菌后，-20 ℃避光保存。

1.2.1.3 MIC/MBC测定：按照微量肉汤稀释法进行。96孔板横排前十孔每孔加入10 μL 水解酪蛋白培养基(MH培养基)后，在第1孔内加入10 μL BBR或者抗生素，均匀震荡后，吸出10 μL加入至第2孔，依次梯度稀释，直至第10孔。之后，每孔加入90 μL细菌培养液，使终体积为100 μL，细菌终浓度为5×10CFU·mL。第11孔中加入100 μL的菌液作为阳性对照，第12孔采用空白NB培养基作为阴性对照。将96孔板在37 ℃培养24～48 h，以24 h无菌生长的最低浓度为MIC，48 h后肉眼无细菌生长的试管中取100 μL菌液涂平板；过夜培养后平板无菌生长的对应肉汤管中的最低药物浓度，即是MBC。每个试验重复3次，每次3个平行。

1.2.1.4 联合抑菌和FIC测定：采用棋盘法进行，96孔板中每横排从左至右依次加入5 μL抗生素(终浓度为2MIC～1/64MIC)，每纵列从上至下依次加入5 μL BBR(终浓度为1/2 MIC～1/32 MIC)，再加入90 μL菌液(终浓度为5×10CFU·mL)，终体积100 μL。分别加入100 μL的菌液和空白培养基为阳性和阴性对照。37 ℃培养24 h，无菌生长的最低浓度为抗生素和BBR联合抑菌MIC。

抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration, FIC)计算方法：

FIC=MIC(联合)/MIC(BBR)+MIC(联合)/MIC(抗生素)

协同：FIC≤0.5；相加：0.52。

1.2.2 时间杀灭曲线测定 设置BBR组(1/4 MIC BBR、1/2 MIC BBR和MIC BBR)、MIC抗生素组和联合组(1/8 MIC BBR+1/32 MIC 抗生素)，以无药物加入的NB培养液为对照，分别加入细菌培养物，使终浓度为1×10CFU·mL。7组试管于37 ℃ 振荡培养，定时取样，稀释后，涂NB平板，37 ℃培养12～24 h 后计数。以时间为横坐标，以菌落总数的对数为纵坐标绘图，即时间杀灭曲线。

1.2.3 电导率测定 取100 μL细菌过夜培养物，稀释50倍后，分别加入BBR、抗生素和联合抑菌液，37 ℃ 振荡培养。于0、1、2、4、6、8 h分别定时取样，5 000 r·min离心10 min，吸取上清液，无菌水均匀稀释，测定电导率。每个试验重复3次，每次3个平行。

1.2.4 膜电位测定 细菌于NB培养基中37 ℃培养12 h，取100 μL过夜培养物分别转接到含有BBR、抗生素和联合抑菌液的培养基中，混合均匀，取100 μL混合液加入96孔板中，过夜培养。用5 μmol·LDiBAC4(3) 缓冲液清洗96孔板3次，加入180 μL 5 μmol·LDiBAC4(3)的缓冲液进行染色，37 ℃孵育30 min，多功能酶标仪3 min检测一次荧光强度。以无细菌的培养基为空白对照。

1.2.5 碱性磷酸酶(AKP)的测定 取100 μL细菌过夜培养物加入5 mL NB培养基中，再分别加入BBR、抗生素和联合抑菌液，37 ℃ 下振荡培养，0、1、2、4、6、8 h 定时取500 μL样品，5 000 r·min离心10 min，用试剂盒测定AKP含量。

1.2.6 荧光实时定量PCR(RT-PCR) 细菌过夜活化，1∶100的比例转接到分别含有BBR、抗生素和联合抑菌液的NB培养基中，37 ℃培养12 h，提取mRNA，再逆转录成cDNA。以cDNA为模板，16S rRNA为内参基因，使用荧光定量试剂盒，测定的表达水平。反应程序：95 ℃ 预变性 30 s；95 ℃ 变性5 s，50～ 60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40个循环；熔解曲线从 65 ℃ 升至 95 ℃，每5 s升温0.5 ℃。

1.2.7 转录组学检测 送北京诺禾致源有限公司协作完成。具体操作为提取样品的总mRNA，使用fragmentation buffer随机将其打断成短片段，按照链特异性建库的方式建库。在M-MuLV逆转录酶体系中，将片段化的mRNA作为模板，随机寡核苷酸作为引物，合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，将dNTPs(将dNTP中的dTTP用dUTP取代)作为原料在DNA polymerase I 体系下合成cDNA第二条链(使第二条链中包含A/U/C/G)，再用AMPure XP beads筛选250～300 bp的cDNA，通过cDNA末端修复、加A尾、连接测序接头，并借助USER酶降解含U的cDNA第二链，再进行PCR扩增并获得文库。

库检合格后，根据有效浓度及目标下机数据量的需求对不同文库pooling后，再按照边合成边测序(sequencing by synthesis)的原理进行Illumina测序。添加4种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物于测序的flow cell中进行扩增，当测序簇延伸互补链时，每添加一个被荧光标记的dNTP即可释放出相对应的荧光，并利用软件将测序仪接收到的荧光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

1.2.8 生物信息学分析 对转录组学测序结果进行GO富集、KEGG富集和差异基因筛选。值≤0.05的通路定义为在显著差异表达基因中显著富集的通路。应用DESeq2方法计算不同样本之间基因表达量的差异，具有统计学显著差异的确定为差异表达基因。值<0.05，FDR≤0.01和差异表达倍数≥2的基因即显著差异表达基因。

2 结 果

2.1 抗生素和BBR单独作用于SA/MRSA的MIC

BBR与抗生素单独作用于SA/MRSA的MIC/MBC见表1。7种抗生素对SA/MRSA均有抑菌效果，但对MRSA的MIC显著高于SA，除万古霉素和氯霉素以外，其他5种抗生素对MRSA的MIC比SA高了100倍～2 000倍之多。其中，阿莫西林对SA的抑菌效果最佳，MIC为0.5 μg·mL；万古霉素对MRSA的抑菌效果最佳，MIC为2 μg·mL。BBR对SA和MRSA的抑菌效果一致，均为1 250 μg·mL。

表1 不同抗生素对SA/MRSA的MIC和MBCTable 1 MICs and MBCs of different antibiotics against SA/MRSA μg·mL-1

2.2 抗生素和BBR联用的FIC

BBR和7种抗生素联用对SA均具有协同抑菌作用，但只与4种抗生素联用能协同抑制MRSA(表2)。其中，1/32 MIC BBR+1/64 MIC青霉素联用对SA具有最小的FIC值0.047，但对MRSA却呈现无关作用；1/32 MIC BBR+1/32 MIC阿莫西林联用对MRSA具有最小的FIC值0.063，1/16 MIC BBR+1/4 MIC左氧氟沙星对SA和MRSA的FIC均为0.313。由于阿莫西林对MRSA的MIC太高，为5 120 μg·mL，而左氧氟沙星仅为128 μg·mL，因此选择左氧氟沙星进行之后的试验。联合抑菌结果表明，BBR不但能够直接抑制MRSA，而且与β-内酰胺类抗生素联合使用能够恢复其对MRSA菌株的敏感性。

表2 BBR与各抗生素联用对SA/MRSA作用对比Table 2 Comparison of the effects of BBR combined with various antibiotics on SA/MRSA

2.3 时间杀灭曲线

为了进一步评价BBR和左氧氟沙星的杀菌效果，作者测定了它们单独和联合分别作用于MRSA的时间杀灭曲线。当MRSA初始接种浓度为1×10CFU·mL时，24 h后MIC BBR组细菌显著下降，为(5.57±0.21)×10CFU·mL(<0.05)；而1/4 MIC BBR组和1/2 MIC BBR组则分别为(6.17±0.15)×10和(6.3±0.2)×10CFU·mL，对照组细菌数可达(1.16±0.04)×10CFU·mL(图1a)。24 h后，MIC左氧氟沙星组细菌数为(6.07±0.29)×10CFU·mL，而联合组则为(4.7±0.2)×10CFU·mL(图1b)。联合组的抑菌效果不如左氧氟沙星单独作用，原因可能是因为复配浓度大幅度降低的原因，但两者联用依然可以抑制MRSA的生长繁殖，达到有效的MIC水平。

a.BBR； b. BBR和左氧氟沙星联合a.BBR; b. The combination of BBR and levofloxacin图1 对MRSA的时间杀灭曲线Fig.1 Time-kill curve of drugs against MRSA

2.4 BBR和抗生素联用破坏MRSA细胞结构

电导率可以衡量细菌细胞膜的通透性，电导率越大，细胞膜被破坏越严重，因此可通过菌液电导率的变化判断细菌细胞膜的受损情况。结果表明，对照组菌液8 h内电导率无显著变化， BBR+左氧氟沙星联合组电导率变化率显著高于对照组但低于BBR组(<0.05)(图2a)。

a.电导率变化；b.荧光强度变化；c.AKP活性a. Conductivity change; b. Fluorescence intensity change; c. AKP activity图2 BBR和抗生素联用破坏MRSA细胞结构Fig.2 The combination of BBR and antibiotics destroyed the cell structure of MRSA

DiBAC4(3)是一种亲脂性阴离子荧光染料，本身无荧光，但它能和细胞质中的蛋白质结合产生强烈荧光，当细胞膜受损，细胞荧光会大幅度增加。结果表明，对照组菌液30 min内荧光强度无显著变化，联合组的荧光强度显著高于对照组而低于BBR组(图2b)。

AKP的活性表明细菌细胞壁的破损程度。8 h内，对照组AKP活性无显著变化，而联合组AKP活性显著高于对照组却显著低于BBR组(<0.05)(图2c)。

2.5 BBR和抗生素联用下调mecA表达

图3表明，BBR显著下调了的相对表达水平，且呈现浓度依赖，与对照组相比，添加1/4 MIC、1/8 MIC和1/32 MIC BBR的分别降低为对照组的16.69%、5.26%和75.19%(<0.05)，说明可能是BBR的作用靶点之一。左氧氟沙星组表达上调26.82倍，而联合组却显著降低的相对表达水平为对照的1.35%(<0.05)。BBR作用于，使得MRSA细胞壁完整性降低，而左氧氟沙星作用于拓扑异构酶II，两者联用能大幅度协同下调的表达。

1. 对照组; 2. 1/4MIC BBR; 3. 1/8MIC BBR; 4. 1/32MIC BBR; 5. 1/64MIC万古霉素； 6. 1/64MIC 万古霉素+1/8MIC BBR； 7. 1/8MIC氯霉素； 8. 1/8MIC 氯霉素+1/4MIC BBR； 9. 1/32MIC左氧氟沙星； 10. 1/32MIC左氧氟沙星+1/8MIC BBR; 11. 1/32MIC阿莫西林； 12. 1/32MIC阿莫西林+BBR 1/8MIC; 13. 1/16MIC红霉素； 14. 1/16MIC 红霉素+BBR 1/8MIC； 15. 1/8MIC四环素； 16. 1/8MIC四环素+BBR 1/4MIC； 17. 1/64MIC磺胺甲恶唑； 18. 1/64MIC磺胺甲恶唑+1/32MIC BBR组1. Control group; 2. BBR 1/4MIC group; 3. BBR 1/8MIC group; 4. BBR 1/32MIC group; 5. Vancomycin 1/64MIC group; 6. Vancomycin 1/64MIC+BBR 1/8MIC group; 7. Chloramphenicol 1/8MIC group; 8. Chloramphenicol 1/8MIC +BBR 1/4MIC group; 9. Levofloxacin 1/32MIC group; 10. Levofloxacin 1/32MIC+BBR 1/8MIC group; 11. Amoxicillin 1/32MIC group; 12. Amoxicillin 1/32MIC+BBR 1/8MIC group; 13. Erythromycin 1/16MIC group; 14. Erythromycin 1/16MIC+BBR 1/16MIC group; 15. Tetracycline 1/8MIC group; 16. Tetracycline 1/8MIC+BBR 1/4MIC group; 17. Sulfamethoxazole 1/64MIC group; 18. Sulfamethoxazole 1/64MIC+BBR 1/32MIC group图3 mecA基因表达变化Fig.3 The mecA expression change of MRSA

2.6 BBR和左氧氟沙星联用的分子机制

GO富集结果(图4)表明，BBR影响MRSA 73个基因的表达，重要的上调基因功能包括氧化还原、氨基酸和维生素的合成与代谢，重要的下调基因功能包括转录和同化。

a. BBR; b. 左氧氟沙星；c. 联合组a. BBR; b. Levofloxacin; c. Combination group图4 差异表达基因GO富集Fig.4 Go enrichment of differentially expressed genes

左氧氟沙星影响MRSA 114个基因的表达，重要的上调基因功能包括有机氮化合物的合成和代谢、细胞酰胺合成和代谢过程以及碳水化合物跨膜转运，重要的下调基因功能包括药物反应、发展过程、对化学物质的反应和磷脂生物合成过程。细胞膜由磷脂双分子层构成，左氧氟沙星使得磷脂合成受到抑制，则细胞膜更易受到破坏，细菌细胞膜通透性增加、细胞形态难以维持。这可能是两者联用导致表达下调的原因之一。

联合组影响MRSA 95个基因的表达，重要的上调基因功能包括维生素合成和代谢、细胞骨架组织、嘧啶化合物代谢过程和硫化合物的生物合成过程，重要的下调基因功能主要包括氨基酸、阴离子、有机酸和羧酸的运输和跨膜转运。

表3～5总结了BBR、左氧氟沙星和联合组的KEGG富集结果。其中，与BBR抑菌有关的可能为维生素B2代谢、β-内酰胺抗性、双组分系统和多样环境中的微生物代谢，与左氧氟沙星组抑菌有关可能为甘油磷脂代谢，与联合组抑菌有关的代谢通路可能为维生素B2代谢和ABC转运体。

表3 BBR KEGG 富集汇总Table 3 KEGG enrichment summary of the BBR group

表4 左氧氟沙星组主要代谢通路的 KEGG 富集汇总Table 4 KEGG enrichment summary of the levofloxacin group

表5 联合组 KEGG 富集汇总Table 5 KEGG enrichment summary of the combination group

2.7 重要的差异表达基因

与对照组相比，BBR、左氧氟沙星和联合组的重要差异表达基因如表6。BBR组和基因表达量与对照组相比分别下调为对照的42.92%和44.05%；BBR组、左氧氟沙星组及联合组中基因表达量均显著下调，分别下调为对照组的46.73%、36.63%和43.67%；在组和联合组均表现为上调，上调倍数分别为2.69和3.64倍。

表6 重要差异表达基因Table 6 Important differentially expressed genes

3 讨 论

β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺核能不可逆地与PBPs的Ser 403位点结合，竞争转肽酶的活性位点从而阻止肽聚糖合成，抑制细胞壁合成，导致细菌死亡。当正常PBPs与β-内酰胺类抗生素结合失去活性时，PBP2a可以代替它们合成继续肽聚糖，从而维持MRSA的生长繁殖。

虽然阿莫西林、青霉素和头孢唑林均作用于MRSA的细胞壁，但它们和BBR联用产生的抑菌效果不同，推测可能是由于它们对MRSA细胞壁的作用靶点不同。PBP2a在其余PBPs失去活性后仍能维持MRSA的细胞壁形态。研究认为，两种药物联用时，作用靶位相同会产生拮抗作用，当联用的两种药物分别作用于不同的PBPs时可产生协同作用；或者两种药物联用，而其中一种发挥β-内酰胺酶作用时，亦可产生协同作用。青霉素作用位点为PBP1，头孢唑林抗菌的作用位点主要为PBP1和PBP3，低浓度的阿莫西林可使PBP4及PBP5达到部分饱和。当三者和BBR联用，头孢唑林和阿莫西林继续协同抑制SA和MRSA，青霉素则失去协同抑制MRSA的效果，这也许说明BBR对MRSA的一个作用位点可能是PBP1。左氧氟沙星主要作用靶位是拓扑异构酶II，因此和BBR具有协同作用。

BBR组的电导率和荧光强度显著高于抗生素组和联合组，可能是因为其能够增加细胞膜通透性，促进物质泄漏。细胞膜不是左氧氟沙星的作用靶点，而BBR可通过增加细胞膜通透性，从而与其产生协同抑菌作用。BBR与左氧氟沙星联用时，荧光强度显著大于对应抗生素组，表明MRSA细胞产生超极化现象，抗生素更易进入细胞内。BBR能提高提升细胞壁通透性，当其降低浓度与左氧氟沙星联用时，细菌AKP活性增高，表明联用后细胞壁进一步受到破坏，细胞形态完整性难以维持，抗生素更容易突破胞壁屏障，进入细胞体内，从而造成更好的杀菌效果。

天然产物往往具有多种抑菌机制，基因可能只是其中一个靶点，为了进一步寻找联合抑菌机制，作者对BBR组、左氧氟沙星组和联合组进行了转录学的研究，对其差异基因进行GO富集、KEGG分析和显著差异基因的比较。

ABC转运体中的fhuA是一种铬铁-铁受体，属于外膜蛋白家族，它与能量转换蛋白TonB一起，介导含铁载体通过革兰阴性菌外膜的主动转运。ABC转运体可催化脂双层的脂类在两层之间翻转，对膜的发生和功能具有重要的意义，还与细菌对药物的抗性有关,其表达下调也许说明MRSA细胞内药物的聚集。

和基因调控MRSA中一种保守的双组分调节系统(two-component regulatory systems, TCSs)，参与生物膜的生成、荚膜多糖的合成、自我分解、抗生素抗性及血红素毒素的抗性等。和编码感应器蛋白(如Spa和Fnba)及细胞壁相关蛋白(如Eap和Emp)。受到外界信号激活后发生自主磷酸化，随后磷酸化，磷酸化的结合到P1启动子区，和RNA聚合酶共同调控转录过程。BBR可通过下调和基因表达，抑制MRSA细胞膜、细胞壁合成和抗生素抗性基因的表达。

和可能是BBR和左氧氟沙星联合抑菌的重要差异基因。

维生素 B2在生物氧化过程中发挥递氧的作用，参与糖、蛋白质和脂肪代谢。基因表达上调不仅限制维生素B2的合成，其基因编码的双功能酶的催化还会导致下游产物5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶的积累，这种高活性嘧啶二酮化合物对细胞的毒害作用可造成细胞自溶。是MRSA的固有多药耐药外排泵，与MRSA的耐药性极度相关。受到左氧氟沙星的诱导后，的表达大幅度增加，从而使进入细胞内的药物被更多更快的泵出体内，最终造成细胞耐药。很多文献已经证实这点，并以为调控靶点，寻找天然外排泵抑制剂。

是一种机械敏感通道(mechanosensitive channels, MS)，是一种跨膜通道蛋白，可感受细胞膜表面的张力。起到“紧急释放阀”的作用，当细菌的外部环境渗透压急剧变化引起细胞膨胀，细胞膜上产生张力时，直接感知张力形成一个直径约为3 nm的通道，释放胞内物质维持渗透压的平衡，从而避免细胞的裂解。基因的下调直接限制了这一调控机制，使得MRSA对外界渗透压变化的耐受能力显著降低，较小的渗透压变化即可使细胞破裂。

4 结 论

BBR不但能够直接抑制MRSA，且与β-内酰胺类抗生素联合使用时能够恢复其对MRSA菌株的敏感性，大幅度降低抗生素的使用水平。BBR和左氧氟沙星联用对MRSA效果最佳，可降低左氧氟沙星的MIC至原来的1/16。联合抑菌的靶点为细胞壁和细胞膜，包括破坏细胞壁，增加细胞膜的通透性，上调和下调和表达水平，从而达到协同抑菌的目的。