基于表面增强拉曼光谱标记技术的生物传感器用于农药残留检测的研究进展

颜朦朦，李慧冬，张文君，陈子雷，郭长英，朱 超,*，佘永新

（1.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，山东 济南 250100；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

天然或合成农药主要用于预防、消除或控制作物疾病、害虫和杂草等。然而，只有不足1%的农药真正发挥了作用，剩余部分进入环境，并在食物链中大量累积和持久残留，进而对人体健康造成影响，如致癌性、遗传毒性和免疫毒性等。因此，农药的监管、监测非常重要。

自20世纪70年代以来，质谱法和色谱法（又称确证方法）被视为农药残留检测的金标准，具有检测灵敏度高、准确性好、精密度高的优点，然而，这些方法所需设备价格昂贵、检测费用高、需专业人员操作，仅适用于实验室检测，不能满足现场检测、进出口口岸及超标事件应急处理的迫切要求。近年来，对农药残留快检方法的研究得到越来越多的关注，如电化学生物传感器、光学生物传感器（荧光、量子点、表面等离子体共振等）、表面增强拉曼光谱（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）技术、聚合酶链式反应法、酶联免疫吸附测定法等，这些方法具有仪器可小型化、可用于现场检测、检测成本低、准确性高、检测速度快等优点，是确证方法的有效补充。

其中，SERS技术因具有检测速度快、特异性强（可提供目标物指纹信息）、灵敏度高、可实现多残留检测等特点，已被广泛应用于食品安全、环境监测、生物医学等领域。SERS技术是一种超灵敏振动光谱技术，用于检测贵金属（金（Au）或银（Ag））纳米结构（通常称为增强基底）表面或表面附近的分子，可将分子原有但微弱的拉曼信号增强至几个数量级（通常为10～10），甚至可达到单分子检测水平，另外，便携式拉曼仪的快速发展更加满足了快检的需求。

现阶段，SERS应用于农药残留检测主要有两种模式：直接检测（无标记）和间接检测（有标记）。直接检测，是增强基底对农药分子直接产生增强作用，利用信息丰富的指纹图谱，达到定性定量的目的，具备分析速度快、特异性强等优点。直接检测技术在农药残留快速检测方面取得了一定研究成果，但现已报道的方法中，仍存在较多问题：其检测灵敏度低，不能满足国家规定的最大残留限量标准；SERS对具有类似结构性质和拉曼活性的同系物选择性较差，难以实现农药多残留同步分析；农产品基质的SERS信号易与农药分子的SERS图谱重合，基质效应严重；且一些农药因结构问题难以通过直接检测将其识别。因此，仅依靠开发新型高增强因子（enhancement factor，EF）的增强基底已不能满足所有农药检测的需求。研究和开发新的SERS检测方法将是一个新的突破点。

SERS间接检测技术又称SERS标记技术，其原理是将贵金属纳米粒子与强拉曼散射分子（拉曼报告分子（Raman reporters，RRs））组成SERS标签，其简易制备过程如图1所示，此类SERS标签具有类似于荧光团的光学标记功能，具有较高灵敏度、较好的分子指纹保真度、强抗光漂白性、图谱范围窄（比荧光窄1/10～1/100）、可多路复用等性能，已成为化学和生物医学检测的优良标记物。SERS标签可以进一步结合识别分子（如抗体、适配体、分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）等），组成基于SERS标记技术的生物传感器，在目标物不具有SERS信号的情况下，对目标物进行定性定量检测。目前SERS标记技术已用于多种危害因子检测，实现了纳米技术、生物分析技术、生物传感的有机结合。近年来，这项技术也逐渐应用到农药残留领域，有效解决了SERS技术用于农药残留检测的部分难题，并取得了突破性成果。然而，目前鲜见综述对基于SERS标记技术的生物传感器在农药残留检测领域的应用研究进展进行全面地总结。因此对其进行概括总结对于将基于SERS标记技术的生物传感器更广泛地应用于农药残留检测，甚至食品安全检测领域具有重要意义。

图1 SERS标签的制备Fig. 1 Preparation of SERS tags

本综述系统总结近年来SERS标记技术应用于农药残留检测的研究进展，首先介绍SERS标签的设计及制备方法；然后根据不同的识别元件（抗体、适配体、MIPs等），介绍SERS标记技术在农药残留检测方面的应用情况；最后总结SERS标记技术在农药残留检测方面的未来发展前景及挑战。

1 SERS标签的设计及制备

1.1 SERS增强基底

在SERS标记方法中，SERS标签对于传感器的检测性能起着至关重要的作用。典型的SERS标签由两个重要部分组成：金属纳米颗粒（SERS增强基底）和RRs。其中，SERS增强基底用于增强RRs的拉曼信号。金纳米颗粒（Au nanoparticles，Au NPs）或银纳米颗粒（Ag nanoparticles，Ag NPs）是最常用的SERS增强基底，可对报告分子的拉曼信号进行显著增强。Au NPs因制备简单，是最常用的增强基底。纳米粒子的形状影响其光学特性，尤其是纳米粒子的边缘和尖角，可实现最高的近场增强，进而提高灵敏度。目前，已报道多种不同类型SERS增强基底，包括纳米棒（nanorods，NRs）、金纳米二聚体（Au nanodimers，Au-NDs）、纳米星、纳米棱镜和纳米球、纳米三角形等。Au NRs是SERS增强基底的最佳备选材料之一，其边缘有很强的SERS增强作用。纳米星和纳米花也是很好的备选材料，因为它们具有更大的比表面积，能够使更多的RRs附着在其表面上。另外，纳米星尖端的相互影响也可以进一步增强SERS信号。此外，因为双金属NPs之间的等离子体耦合可产生巨大的电磁增强，核心-壳型金属纳米颗粒也被广泛用于制备SERS标签，如Au@Ag NPs、Au NRs@Ag、Au@Au-Ag NPs、Au@Pd@Pt NRs等。改善SERS增强的另一个重要方法是通过促进纳米粒子的聚集来创建更多的“热点”。这些增强基底都可以应用于SERS标签的设计，并应用到农药残留检测中。

1.2 拉曼报告分子

RRs是SERS标签的信号源。常用的RRs通常包含巯基（-SH）或氨基（-NH）基团，例如孔雀石绿异硫氰酸酯（malachite green isothiocyanate，MGITC）、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、4-氨基苯硫酚（4-aminophenylthiophenol，4-ATP）、4-巯基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）、4-巯基吡啶（4-mercaptopyridine，4-MPY）、罗丹明6G（rhodamine 6G，R6G）、4,4’-联吡啶、2,2’-联吡啶、4-氨基苯硫醇（4-aminobenzenethiol，4-ABT）、3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid）、4-甲基卞硫醇（4-methoxybenzyl mercaptan，4-MATT）、4-硝基硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）等，这些RRs有如下共同特点：1）这些分子可以很容易且牢固地附着在金属纳米粒子表面；2）这些分子的散射截面高从而能够获得强拉曼信号。但现阶段常用的RRs的SERS图谱出现在600～1 800 cm范围内，常与基质的SERS图谱重合，抗基质效应性能差。近年来，一些具有炔烃、氰、叠氮化物等外源基团的化合物被应用于构建SERS标签，这些新型标签在1 800～2 800 cm的细胞拉曼沉默区表现出明显的拉曼散射峰，可避免与生物基质的SERS图谱重合，进而避免背景信号干扰。且已成功应用于农药残留检测。总之，SERS标签设计的宗旨是保证高的灵敏度及化学和物理稳定性。

2 SERS标记技术应用于农药残留检测

本部分从检测原理、检测效果等方面系统归纳近年来基于不同识别分子（抗体、适配体和MIPs）的SERS标记技术用于农药残留的检测方法。不同识别分子的SERS标记生物传感器如表1所示。

表1 基于不同识别分子的SERS标记生物传感器应用于农药残留检测Table 1 SERS label-based biosensors with different recognition elements for pesticide residue detection

2.1 基于SERS标记技术的免疫传感器

抗原-抗体免疫反应是生物传感器最常用的识别机制，可提高SERS技术的选择性和敏感性。抗体是一种大分子质量Y形蛋白，也称为免疫球蛋白，它是通过在动物体内免疫产生的，可对各种分析物（抗原）靶向特异性识别。农药分子一般是小分子，其免疫原性差，通常需要通过分子结构的设计和改造与蛋白质分子结合，再进行动物免疫，进而得到活性强的抗体。一般来讲，抗体对农药分子只有一个识别位点，需要通过竞争法进行农药残留的检测。在此免疫反应中主要包括3 个部分：SERS标签、竞争免疫基底和识别探针。基于以上机理，Li Xiaozhou等提出了一种基于SERS的免疫层析（immunochromatographic assay，ICA）方法，用于氯氰菊酯和高氰戊菊酯农药的双重检测，如图2A所示，该学者以Au NPs为增强基底，以4-MBA、4-ATP为RRs，制备了SERS标签，然后再通过共价键作用，将抗体修饰在SERS标签的表面，形成识别探针；并将农药分子与鸡卵清白蛋白的复合物固定在试纸条上，形成竞争基底物。不同的是，该试纸条具有两条检测线，由于两个RRs的特征峰出现在不同位置，可用同一波长激光激发，进而进行多残留检测。此方法对氯氰菊酯和氰戊菊酯两种农药残留的检测限分别为2.3×10ng/mL和2.6×10ng/mL，其灵敏度比酶联免疫吸附试验法和荧光ICA法高3～4 倍，且对于自来水、河水等实际样品中两种农药残留的检测具有良好的回收率。为了避免基质效应，Sun Yue等进行了以4-巯基苯甲腈（4-mercaptobenzonitrile，4-MBN）为RRs的SERS标记免疫实验，4-MBN的SERS特征峰出现在1 800～2 800 cm处，可以有效避开出现在低于1 800 cm处农产品基质的拉曼特征峰；该学者另以Au NRs@Ag为增强基底，制备SERS标签，在标签的表面修饰农药抗原分子，作为竞争基底物，在磁性纳米粒子的表面修饰抗体，用以识别农药分子，通过竞争反应，成功应用于河水和苹果汁中吡虫啉的检测，回收率在96.8%～100.5%之间（图2B）。

抗体用于农药分子识别时也存在一些问题，如农药小分子结构改造难度大，不易得到免疫原性高的抗原，进而难以得到有效抗体；另外抗体制备、纯化过程非常复杂，生产成本高；制备出的抗体贮藏稳定性受温度、pH值、有机溶剂等条件影响大。因此，寻求其他特异性强的识别元件显得尤为重要。纳米抗体的研究可有效解决部分问题，若与SERS标记技术相结合，应能推进免疫传感器的进一步发展。

2.2 基于SERS标记技术的适配体传感器

图2 基于SERS标记技术的免疫传感器Fig. 2 SERS label-based immunosensors

适配体经体外筛选得到，是长度一般在20～80 个核苷酸之间的单链寡核苷酸或者短的多肽。适配体和靶标农药通过氢键、范德华力、疏水作用等作用力进行特异性识别与结合。在靶标农药存在的情况下，适配体与靶分子相互作用，将自身折叠成各种三维结构，包括G-四联体、发夹结构和T-结构等。与抗体相比，适配体作为识别元件有以下几个优点：1）适配体的合成是在体外进行的，不需要动物实验；2）由于小分子的低免疫原性，抗体通常需要在免疫前与载体蛋白结合以获得有效抗体。而对于小分子的适配体可以从体外直接分离得到；3）由于分离适配体通常只需几周时间，因此它可以很大程度上节省时间；4）与基于抗体的免疫分析方法相比，通过使用各种基于核酸的信号放大技术，可以进一步提高生物传感器的检测灵敏度；5）适配体还具有其他一些优异的特性，如所能适应的温度和pH值范围较宽、易于化学合成、批次间的差异性较小、易于修饰标记分子等。适配体在生物传感器的应用有效增加了识别元件的种类。Sun Yue 等以适配体为识别元件，以Au NPs为增强基底，以4-(巯基甲基)苯甲腈（4-(mercaptomethyl) benzonitrile，MMBN）为RRs，制备了MMBN-Au NPs-适配体识别探针，然后在Ag NPs修饰的硅片上固定适配体识别链用作竞争基底物，通过竞争法实现了啶虫脒的灵敏检测，检测限达到6.8 nmol/L，并成功应用到苹果汁中啶虫脒的检测，其检测原理如图3A所示。Wei Xiao’ou等同样使用MMBN为RRs，以Ag NPs为SERS增强基底，制备MMBN-Au NPs-适配体识别探针，然后在FeO@Au核壳纳米粒子上修饰适配体识别链用作竞争基底物，完成了樱桃番茄和葡萄中阿特拉津的灵敏检测，回收率在98.7%～106.6%之间（图3B）。Lu Yuxiao等利用DNA可以形成四面体结构的优势，构建了多残留SERS-适配体生物传感器，如图3C所示，四面体骨架的4 个角是由1 个Ag@Au NPs纳米粒子及3 个修饰有不同RRs（4-ATP、4-NTP和4-MATT）的Ag@Au NPs纳米粒子组成，其检测原理如下：首先将3 种农药的适配体嵌入到DNA四面体骨架中的3 个边缘，当适配体识别农药分子时，随着适配体结构变化，DNA四面体也随着变化，Ag@Au NPs纳米粒子就会相互接近，形成SERS热点，进而测得不同RRs的拉曼信号，实现农药分子的检测，最终最低可检测到0.002 1 ng/mL的丙溴磷、0.004 6 ng/mL的啶虫脒以及0.006 1 ng/mL的多菌灵；通过实际样品的添加回收试验可知，该法与高效液相色谱-质谱法具有较好的一致性。

适配体在农药分子检测中的应用受到越来越多的关注，但是农药分子的适配体种类还是相对较少，急需筛选得到更多的适配体以供实际应用，另外在基质中适配体与靶标分子的结合性能还需要进一步优化。

2.3 基于SERS标记技术的仿生免疫传感器

图3 基于SERS标记技术的适体传感器Fig. 3 SERS label-based aptasensors

MIPs仿生识别元件，属于超分子研究领域，其制备过程如下：首先印迹分子（靶标或靶标分子类似物）与功能单体之间通过非共价键和/或共价键结合，形成主客体配合物；然后再加入交联剂及引发剂，通过聚合反应，形成高分子聚合物；最后通过适当的方法将印迹分子洗脱或解离，形成具有识别印迹分子及靶标分子结合空腔的聚合物。

MIPs因具有特异性高、易制备、成本低、化学及物理稳定性好的优点而常被用作前处理材料。与SERS技术结合时，通常将MIPs修饰在SERS增强基底的表面用于识别农药分子，起到聚集农药分子的作用，进而对农药分子进行SERS直接检测，而与SERS标记技术结合的研究较少。2019年，Yan Mengmeng等创建了仿生纳米酶酶联免疫吸附实验（biomimetic nanozyme-linked immunosorbent assay，BNLISA）用于三唑磷SERS与比色双模式检测，首先合成三唑磷均匀MIPs微球，通过离子液体均匀的固定在96 孔阵列板上，形成识别元件。然后在三唑磷抗原分子上标记纳米酶，纳米酶可以催化四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）为氧化TMB（TMB），TMB与SERS增强基底反应后会产生很强的SERS信号，而且，其颜色变化可用肉眼观察到。此方法属于SERS间接标记技术，可用SERS及比色双模式检测方法测定梨中三唑磷农药残留，其检测原理如图4所示。

MIPs作为仿生识别分子已应用多种有害因子的检测，但仍存一些问题，如识别特异性有所欠缺，有些MIPs只能用于有机相识别目标分子，另外，对农药分子的MIPs与SERS标记技术相结合的研究仍较少。

图4 BNLISA用于三唑磷SERS与比色双模式检测[54]Fig. 4 BNLISA for colorimetric and SERS sensing of triazophos[54]

3 结 语

本综述总结了近年来SERS标记技术在农药残留检测领域的应用情况，SERS标记技术具有成本低、灵敏度高、多路复用性能好的特点，但是这些研究仍仅适用于实验室，如将其工业化应用，仍需要做出更多的努力。在此提出以下建议：1）为了保证SERS信号的灵敏度、稳定性和再现性，应重点制备具有重复性好、稳定性强和均匀性高的SERS标签。其中，使用RRs内标校正SERS信号的波动是实现可靠定量SERS分析的有效方法。另外，SERS增强基底的稳定性、均一性非常重要，近期，利用3D技术制备贵金属纳米粒子以改善粒子的均一性受到研究者的青睐。二维材料具有独特的光学特性和较大的比表面积（可克服传统贵金属纳米材料的缺点）也开始被应用于SERS增强基底。2）食品基质非常复杂，很容易干扰SERS标签的SERS信号，因此避免基质效应是保证方法准确性的重要措施。为解决这一问题，有些研究人员在SERS标签的表面修饰一层保护层，如二氧化硅、二氧化钛、脂质体等，其中二氧化硅因具有化学惰性、机械稳定性、表面易修饰等特点而成为最常用的保护层。核-壳型纳米粒子也受到研究者的青睐，一般由两种贵金属组成，RRs存在于两种贵金属之间的缝隙中，其信号不仅可被增强，而且不易受外界环境的影响，但是外层的贵金属层仍会增强非靶标物质信号，受基质影响较大。另外，一些具有炔烃、氰、叠氮化物等外源基团的化合物作为RRs用于构建SERS标签也有效解决了部分问题。同时，快速、效率高、通量高的前处理方法应与生物传感器相结合以消除部分基质效应。3）高通量、快速准确是农药残留检测方法的发展趋势，传统RRs指纹图谱复杂易重合，不利于多残留方法的构建，因此增加特征峰不易重合的外源化合物可用种类显得非常重要。4）识别元件决定传感器的特异性，但受环境影响较大，且现有的种类依然不能满足靶标多样性的需求，应提高识别元件的性能，并加强不同靶标识别元件的研究。5）简单、快速、低成本、可现场检测及高通量检测平台应与SERS标记技术生物传感相结合，如阵列试纸条、微流控芯片，阵列检测板等，并配套开发可多通路同时检测的便携式拉曼光谱仪。总之，相信随着研究的深入，SERS标记技术将能够更加有效地应用于农药残留检测，并拓展到食品安全检测。