动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用

马 岩，王中江，杨靖瑜，李 哲，彭 霞，陈昱凤，李柏良,*

（1.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁 沈阳 110034；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性和复发性胃肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎。IBD的病因还不明确，其发病机制与严重程度受到多种因素影响，其中主要包括遗传因素、免疫反应、肠道菌群和氧化应激等因素。在IBD的发展过程中，过度的免疫反应会导致组织损伤，肠道菌群失调不仅会引起肠道炎症，还会改变肠道微环境，并引发机体代谢紊乱。目前治疗IBD的药物主要是抗炎或免疫抑制药物，如氨基水杨酸、皮质类固醇和硫嘌呤，但这些药物往往会引起严重的副作用。

肠道微生物在人类能量代谢和免疫过程中起着至关重要的作用，越来越多的证据表明，肠道微生物失调与某些人类疾病有关，如肥胖、过敏、IBD和2型糖尿病等疾病。肠道微生物的组成与宿主免疫系统密切相关，研究发现IBD患者肠道中厚壁菌门的相对丰度增加，而拟杆菌门的相对丰度下降。且有研究证明，与健康受试者相比，溃疡性结肠炎患者的潜在致病菌相对丰度增加。致病菌入侵肠上皮细胞后会破坏肠上皮屏障的完整性，并触发肠道炎症反应，因此，肠道微生物可能是溃疡性结肠炎治疗的一个重要潜在靶点。

益生菌是一类定植于肠道对宿主健康有益的活的微生物，其中包括具有干预肠道炎症作用的乳酸菌和双歧杆菌。双歧杆菌在减少条件病原体的定植、维持宿主微生物稳态、保护肠道黏膜屏障的完整性和调节肠道炎症方面发挥其特定作用。此外，一些研究已经报道了双歧杆菌对结肠炎具有缓解作用，Chen Yang等研究发现，短双歧杆菌可通过抑制炎症细胞因子、增强肠上皮屏障功能和调节肠道菌群有效减轻葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的结肠炎。Din等的研究表明双歧杆菌ATCC29521可通过调节miRNA相关的紧密连接蛋白和核转录因子（nuclear transcription factor，NF）-κB通路以及在一定程度上恢复菌群失调来缓解DSS引起的溃疡性结肠炎。

本团队前期研究发现动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有预防溃疡性结肠炎的作用，因此，本研究旨在探讨动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用及其潜在机制，采用体质量变化率、结肠长度、疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活力和组织病理学分析评价动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对DSS诱导的溃疡性结肠炎的缓解作用，并通过研究细胞因子、肠道屏障和核NF-κB信号通路相关基因表达、肠道菌群及短链脂肪酸含量探索动物双歧杆菌乳亚种XLTG11缓解小鼠溃疡性结肠炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性8 周龄C57BL/6N小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：SCXK（京）2016-0006）。

动物双歧杆菌乳亚种XLTG11由东北农业大学食品微生物实验室提供。

MPO活力测定试剂盒 南京建成生物有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-10和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α酶联免疫吸附测定试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 泉州科诺迪生物技术有限公司；细菌总DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；GoScript™ Reverse Transcription Mix试剂盒、GoqPCR Master Mix 普洛麦格（北京）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；TGL-16G离心机 上海安亭科技仪器厂；超低温冰箱 青岛海尔集团；Model 680型酶标仪美国Beckman公司；ABI7500荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与饲养

将45 只8 周龄C57BL/6N雄鼠适应性饲养1 周后随机分为3 组，每组15 只，即正常组、模型组、双歧杆菌组。适应性饲养7 d后，正常组在整个实验阶段内正常摄食与饮水，每天灌胃0.2 mL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.4，后同）；模型组自由饮用3%（质量分数，下同）DSS水溶液7 d诱导溃疡性结肠炎模型，随后每天灌胃0.2 mL无菌PBS，持续2 周；双歧杆菌组饮用3% DSS水溶液7 d诱导溃疡性结肠炎模型，随后根据前期研究结果，每天每只小鼠灌胃1×10CFU动物双歧杆菌乳亚种XLTG11（用PBS调整菌体浓度为5×10CFU/mL，每次取0.2 mL用于灌胃），持续2 周。

1.3.2 小鼠体质量变化率、结肠长度、疾病活动指数和结肠组织MPO活力测定

实验的第1天和最后1 d天称量小鼠的体质量，麻醉后，小鼠颈椎脱臼处死，参照文献[15]测量小鼠结肠长度/cm，并称量小鼠结肠质量。体质量变化率按下式计算。

采用MPO生化试剂盒测定结肠组织中MPO活力。通过DAI评分评估结肠炎严重情况。DAI评分包括体质量变化率、粪便性状和隐血/便血情况，DAI结果以3 项评分之和表示，具体评分标准如表1所示。每天测量体质量，观察粪便性状和隐血/便血情况。粪便隐血情况采用邻联甲苯胺法测定，具体步骤操作如下：1）尽快收集粪便标本涂在白瓷板上；2）滴加邻联甲苯胺液2 滴（约0.1 mL）于粪便不同位置；3）滴加氧化剂2 滴（约0.1 mL），立即计时并观察颜色变化。4）2 min内有蓝色出现，粪便隐血实验为阳性，2 min内不显色为阴性。

表1 DAI评分标准Table 1 Criteria for DAI evaluation

1.3.3 结肠组织病理学观察

取小鼠远端结肠组织用4%（体积分数）甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡后用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察小鼠结肠组织病理学变化。

1.3.4 结肠组织细胞因子质量浓度测定

结肠组织细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）质量浓度的测定分别参照对应ELISA试剂盒说明书。

1.3.5 荧光定量PCR检测

取适量结肠组织样本，利用组织匀浆机进行匀浆，参照RNA提取试剂盒说明书提取结肠组织内的总RNA，按照GoScript™ Reverse Transcription Mix试剂盒操作步骤进行反转录反应合成cDNA，按照GoqPCR Master Mix试剂盒配制反应液，用实时荧光定量PCR系统进行扩增。引物信息如表2所示，反应条件： 95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，循环40 次，根据2法计算样本中目的基因mRNA的相对表达水平。

表2 实时荧光定量PCR引物序列的设计Table 2 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction

1.3.6 小鼠肠道菌群分析

取出小鼠结肠内容物置于灭好菌的冻存管中，立即放入液氮中，然后转移至-80 ℃冰箱保存，每组随机选择3 个样品送到哈尔滨博泰基因有限公司对小鼠肠道内容物的基因V3～V4区域序列进行高通量测序。按照试剂盒说明书提取各组小鼠的肠道内容物中的微生物DNA。通过1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳检查DNA纯度，并使用NanoDrop 2000分光光度计检测DNA的浓度和总量。以细菌基因组为模板利用高保真酶扩增16S rDNA的V3～V4区，引物为V3F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；V4R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’，并在引物5’端加上标签序列。将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测验证。回收并纯化PCR产物，通过Qubit 3.0荧光光度计进行定量分析，构建Miseq文库，利用Illumina Miseq平台进行测序。过滤后的数据参考文献[16]使用FLASH（V1.2.7）软件进行拼接并去除没有重叠关系的测序序列，使用UCHIME算法去除嵌合体序列，以获得高质量的序列标签。使用Uparse软件对具有97%序列同源性的序列标签进行聚类，得到操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的代表序列。使用PyNAST软件与GreenGene数据库进行序列对比，对OTU进行分类信息注释。使用MUSCLE软件生成系统发育树并对OTU丰度信息进行标准化。通过QIIME软件（V1.7.0）和R软件（V3.4.1）分析物种组成。

1.3.7 结肠中短链脂肪酸含量测定

准确称取（0.800±0.010）g盲肠内容物放入粪便样本盒中，用HALO-F100粪便处理仪处理，配制10%（质量分数）悬浊液，取500 μL悬浊液于1.5 mL离心管中，并加入100 μL巴豆酸偏磷酸溶液（75 mmol/L），-30 ℃冻藏24 h，解冻后8 000×离心3 min（4 ℃）去除蛋白质等杂质，取上清液用0.22 μm水系膜过滤后采用气相色谱方法测定短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）含量。

1.4 数据统计与分析

实验结果采用平均值±标准差表示，并采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较进行显著性差异分析。＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。采用Origin 18.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠体质量、结肠长度、疾病活动指数、MPO活力的影响

如图1所示，相比于正常组小鼠体质量变化率和结肠长度，DSS可以引起小鼠体质量变化率和结肠长度的显著降低（＜0.05、＜0.01），相比于模型组，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著（＜0.05、＜0.01）提高体质量变化率和结肠长度。相比于正常组，模型组的DAI（7.03±0.25）和MPO活力（（0.77±0.04）U/g）均极显著增加（＜0.01），表明溃疡性结肠模型建造成功。相比于模型组，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以极显著降低DAI和MPO活力（＜0.01）。

图1 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠体质量变化率（A）、结肠长度（B）、DAI（C）、结肠组织MPO活力（D）的影响Fig. 1 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on body mass (A),colon length (B), DAI (C) and intestinal MPO (D) activity of mice with ulcerative colitis

2.2 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响

从图2可观察到，正常组小鼠杯状细胞丰富，肠腺丰富且排列整齐，黏膜下层间隙大小均匀，无炎性细胞浸润；而模型组结肠水肿严重，黏膜层大面积坏死，黏膜层隐窝结构消失，伴有炎性细胞弥散性浸润；与模型组相比，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11明显降低炎性细胞浸润程度，改善DSS引起的结肠组织病理学变化。

图2 各组小鼠结肠HE染色结果Fig. 2 Hematoxylin-eosin staining of colonic tissue of mice in each group

2.3 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠结肠细胞因子的影响

本实验采用ELISA试剂盒检测小鼠结肠中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的质量浓度，研究动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎炎症因子的影响。如图3所示，与正常组相比，模型组促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的质量浓度均极显著升高（＜0.01），而抑炎细胞因子IL-10的质量浓度极显著下降（＜0.01）。通过动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可极显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度（＜0.01），同时使IL-10质量浓度显著升高（＜0.05）。

图3 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠中细胞因子质量浓度的影响Fig. 3 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on cytokine contents in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.4 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对肠道屏障相关基因mRNA相对表达水平的影响

结肠紧密连接蛋白和黏蛋白的mRNA相对表达水平如图4所示，与正常组相比，模型组闭合蛋白-1（Claudin-1）、闭合蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白（zonula occludens，ZO）-1和黏蛋白2（mucin 2，MUC2）的mRNA相对表达水平均极显著降低（＜0.01），表明上皮完整性已受损。与模型组相比，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11极显著提高了、、和mRNA相对表达水平（＜0.01、＜0.05）。

图4 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道屏障相关基因表达水平的影响Fig. 4 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on relative expression levels of intestinal barrier-related gene in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.5 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群物种组成的影响

如图5A所示，在门水平上，3 组肠道菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，与正常组相比，模型组小鼠的拟杆菌门和变形菌门（Proteobacteria）相对丰度增加，厚壁菌门和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度降低。动物双歧杆菌乳亚种XLTG11干预后可以增加小鼠厚壁菌门和放线菌门的相对丰度，并且降低拟杆菌门和变形菌门的相对丰度。

图5 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道菌群物种组成的影响Fig. 5 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on the composition of gut microbiota in mice with ulcerative colitis

如图5B所示，在属水平上，相比于正常组，模型组小鼠的肠道菌群中双歧杆菌属（）、乳杆菌属（）、粪杆菌属（）、布劳特氏菌属（）、罗斯氏菌属（）的相对丰度降低。此外，模型组小鼠肠道菌群中的脱硫弧菌属（）、幽门螺杆菌属（）和弯曲杆菌属（）的相对丰度增加。动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以逆转这些菌属的变化。

2.6 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠结肠内短链脂肪酸含量的影响

本研究进一步分析肠道中短链脂肪酸的含量，结果如图6所示，与正常组乙酸、丙酸和丁酸含量相比，模型组的乙酸、丙酸和丁酸的含量均极显著降低（＜0.01），而动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以极显著地增加乙酸、丙酸和丁酸的含量（＜0.01）。

图6 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠内短链脂肪酸含量的影响Fig. 6 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on fecal short chain fatty acid contents in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.7 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎小鼠结肠NF-ĸB信号通路的影响

本研究进一步分析NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达水平的变化，结果如图7所示，与正常组相比，模型组中kappa B抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）β和的mRNA表达水平极显著上调（＜0.01），NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）-α的mRNA表达水平极显著下调（＜0.01），而动物双歧杆菌乳亚种XLTG11能够极显著改善以上基因的表达水平（＜0.01）。

图7 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达水平的影响Fig. 7 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on the mRNA relative expression levels of genes related to NF-κB signaling pathway in mice with ulcerative colitis

3 讨 论

IBD的患病率在全球范围内不断增加，给家庭和社会带来了巨大的医疗负担。本团队前期研究表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有预防溃疡性结肠炎的作用，因此，本实验系统地研究动物双歧杆菌乳亚种XLTG11缓解溃疡性结肠炎的效果及可能机制。

DAI对溃疡性结肠炎的临床进展具有重要的评价作用。MPO活力可以反映中性粒细胞的炎症浸润程度，被认为是DSS诱导结肠炎炎症水平的标志。动物双歧杆菌乳亚种XLTG11干预可以有效地降低以上指标，表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有缓解溃疡性结肠炎的作用。DSS诱导的溃疡性结肠炎与人类溃疡性结肠炎的病理学变化非常类似，本研究发现DSS可引起结肠水肿严重，黏膜层大面积坏死，黏膜层隐窝结构消失，伴有炎性细胞弥散性浸润，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11干预可有效改善DSS引起的病理学变化，这与Zhang Dongyang等研究结果一致。溃疡性结肠炎与炎症因子水平密切相关，DSS诱导的溃疡性结肠炎可以产生大量的促炎细胞因子，严重破坏上皮细胞层。因此，本研究采用ELISA法检测DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中细胞因子的质量浓度。结果发现DSS可以显著地提高小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度而降低IL-10的质量浓度。Alex和Boussenna等的研究也发现，结肠组织中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）水平会随着DSS的暴露而显著升高，TNF-α还能破坏肠上皮细胞，诱导结肠上皮细胞凋亡，引起肠黏膜损伤，过量的IL-1β促进了其他炎症因子的表达，增强了内皮细胞和上皮细胞的通透性，加重了肠黏膜的炎症。IL-6是一种促炎因子，在炎症反应和免疫调节过程中发挥重要作用。IL-10是一种抗炎因子，可抑制促炎因子的释放，减少炎症反应，这与Yan Shuang等研究结果较为一致。

紧密连接在肠道上皮细胞表面形成黏膜屏障，其异常表达导致屏障结构破坏，是肠道炎症的启动因子。紧密连接主要包括Occludin、Claudins、ZO-1和ZO-2，它们是肠黏膜屏障的主要成分，影响肠黏膜的通透性和完整性。Claudins在肠上皮稳态和炎症的表达和调节中发挥关键作用，Occludin是一种整体跨膜蛋白，是紧密连接蛋白中最重要的蛋白分子之一，在协调细胞旁路屏障功能和平衡肠道上皮细胞通透性方面发挥着重要作用。缺乏紧密连接会增加肠道屏障的通透性，导致细菌和潜在有害抗原的入侵，进而引发肠道炎症的发生。黏蛋白包括MUC1和MUC2等，在肠道上皮细胞表面形成黏膜屏障，其异常表达导致屏障结构破坏，是肠道炎症的启动因子。在本研究中结果表明，与正常组相比，DSS干预显著下调了、、和mRNA相对表达水平，而动物双歧杆菌乳亚种XLTG11干预可以显著提高、、和mRNA相对表达水平，表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以通过提高肠道屏障功能进而可以缓解溃疡性结肠炎。这与长双歧杆菌CCM 7952可以上调小鼠肠道上皮中ZO-1和Occludin的表达，降低结肠通透性的结果一致。

大量的研究表明肠道菌群在IBD中起关键作用。溃疡性结肠炎通常会引起肠道菌群紊乱，其中厚壁菌门和拟杆菌门是肠道内相对丰度最多的两个菌门，与肠道健康密切相关。在本研究中，与正常组相比较，模型组小鼠的拟杆菌门和变形菌门相对丰度增加，厚壁菌门和放线菌门的相对丰度降低，这与Shi Jialu和Fujio-Vejar等研究结果一致。在属水平上，模型组小鼠肠道菌群中的脱硫弧菌属、幽门螺杆菌属和弯曲杆菌属的相对丰度增加，这与Yu Peng等的研究结果较为一致。以上菌属均属于致病菌，肠道致病菌可以侵袭肠道黏膜，导致肠道内微生态紊乱，破坏肠道黏膜正常功能。此外，有研究报道，幽门螺杆菌属和弯曲杆菌属于变形菌门，而且可以分泌具有特定的脂质A结构的脂多糖，脱硫弧菌可以分泌脂多糖，从而加重溃疡性结肠炎和CD。相比于正常组，模型组小鼠的肠道菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属、粪杆菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属的相对丰度降低，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以逆转这些菌属的变化。双歧杆菌属是一种广泛使用的益生菌，可以产生乙酸，而且双歧杆菌可以缓解小鼠肠道炎症。乳杆菌属是知名的益生菌，其代谢产物乳酸可以转化为短链脂肪酸，通过小鼠模型已经证明其具有减轻溃疡性结肠炎的作用。粪杆菌属和布劳特氏菌属是丁酸产生菌，粪杆菌属与肠道健康完整性密切相关，也有研究表明粪杆菌属在溃疡性结肠炎患者中显著降低。布劳特氏菌属与促炎细胞因子呈负相关关系。Tan Bei等报道罗斯氏菌属可以通过产生短链脂肪酸缓解溃疡性结肠炎。

基于以上肠道菌群的变化，本研究进一步分析短链脂肪酸含量的变化，结果表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以极显著提高短链脂肪酸的含量（＜0.01），Tayyeb等研究表明短链脂肪酸可以通过抑制NF-κB通路抑制溃疡性结肠炎。NF-κB是一个重要的转录因子，负责调节炎症反应。本研究发现双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以显著上调的表达，而下调和的表达。IKK主要包括IKKα和IKKβ亚基，可以控制NF-κB的活性，IKK的活性主要由其IKKβ亚基的磷酸化决定。IκB是NF-κB的抑制因子，二者在细胞质中紧密结合，当IκB被IKKβ磷酸化后，NF-κB进入细胞核，激发炎症反应。以上结果表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11的干预可以通过调节NF-κB信号通路缓解溃疡性结肠炎，这与Ghadimi等关于动物双歧杆菌R101-8缓解溃疡性结肠炎的结果相一致。然而，与炎症相关的信号通路途径不仅是NF-κB，因此，后续研究需要进一步分析其他炎症相关信号通路，如c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等。

综上，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以提高DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠的体质量变化率、结肠长度，降低DAI、MPO活力和促炎细胞因子的质量浓度，调节肠道菌群组成，提高短链脂肪酸含量，上调肠道屏障相关基因的表达并抑制NF-κB信号通路的激活。