南极磷虾油、鱼油与花生四烯酸油对骨质疏松症小鼠脂质代谢的影响

白晓琳，薄钰莹，丁 宁，王庆慧，韩立华，王静凤,*

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.青岛墨尔文中学，山东 青岛 266106）

骨质疏松是一种常见的骨代谢失衡疾病，表现为骨质流失、骨微结构损伤和骨髓脂肪增多等。临床数据表明，骨质疏松和机体的脂质代谢紊乱密切相关。在绝经后妇女中，骨密度与总胆固醇、低密度脂蛋白水平呈显著负相关；且大量研究表明，骨质减少的患者骨髓脂肪含量高于健康人群。骨髓是唯一的脂肪细胞和骨细胞直接相互作用的组织，骨髓脂肪组织位于骨髓腔内，在健康成人体内占总脂肪比例超过10%，在衰老及骨质疏松、糖尿病等许多疾病中具有重要作用。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和花生四烯酸对于机体脂质代谢具有重要作用。研究表明补充DHA、EPA后，高脂饮食小鼠白色和棕色脂肪组织中的脂质积累量降低。二十碳五烯酸磷脂酰胆碱（eicosapentaenoic acid-phosphatidylcholine，EPA-PC）和二十碳五烯酸磷脂酰丝氨酸（eicosapentaenoic acidphosphatidyl serine，EPA-PS）可抑制肝脏脂肪酸合成，通过增强肝脏脂肪酸β氧化改善脂质代谢紊乱。转录组学研究结果显示，适量补充花生四烯酸可降低肝脏脂肪积累，其调节脂质积累效应具有剂量依赖性。不同分子形式的DHA、EPA对脂质代谢的影响不同，常见形式包括乙酯型和甘油三酯型，而关于磷脂型DHA、EPA的研究相对较少，且大多数研究聚焦于DHA、EPA及花生四烯酸单独的多不饱和脂肪酸对于脂质代谢的影响，对于骨质疏松症脂质代谢的研究也鲜见系统报道。

因此，本研究采用市面上最常见的-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）补充剂，富含乙酯型DHA和EPA的鱼油（fish oil，FO），与富含磷脂型DHA和EPA的南极磷虾油（Antarctic krill oil，AKO）作对比；并通过最具代表性的-6 PUFA花生四烯酸油（arachidonic acid oil，AAO）作为对照，探究两种不同分子形式的DHA、EPA与花生四烯酸对骨质疏松脂质代谢的影响，旨在为骨质疏松症患者饮食提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康雌性C57BL/6J小鼠，8 周龄，体质量（18.0±2.0）g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2015-0001。动物饲养环境温度为（23±1）℃，相对湿度为40%～50%，12 h/12 h明暗交替，实验期间自由饮食饮水。

AKO（磷脂质量分数为60.38%，脂肪酸组成中EPA相对含量为26.32%、DHA相对含量为16.64%，比例约为3∶2，EPA与DHA总相对含量为42.96%）由中国海洋大学食品科学与工程学院食品科学与人类健康实验室提供；FO（总脂肪酸质量分数为99.15%，其中，EPA相对含量为49.29%、DHA相对含量为32.53%，比例约为3∶2，EPA与DHA总相对含量为81.82%）购自陕西森朗生物化工有限公司；AAO（基于生物合成技术获得的一种-6多不饱和脂肪酸油剂；花生四烯酸质量分数为46.21%）购自武汉嘉必优生物工程有限公司。

总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒 上海生工生物工程公司；M-MLV逆转录酶 日本TaKaRa公司；荧光染料 瑞士罗氏公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS双能X射线骨密度仪意大利I’CAN公司；YLS-16A小动物骨骼强度测定仪济南益延科技发展有限公司；BH-2型显微镜 日本Olympus公司；RM-2016型石蜡切片机 徕卡仪器（上海）有限公司；GL-20M型高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器公司；Ultra Trurrax T18 basic 型高速匀浆机德国IKA公司；Model680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；LightCycler480s实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 德国Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 动物建模与实验设计

50 只8 周龄健康雌性C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后，随机选取10 只小鼠不进行去卵巢手术，但进行开腹腔与缝合的假手术，以其作为假手术组（Sham），另外40 只进行双侧去卵巢手术以建立骨质疏松症模型。术后3 d，将建模成功的小鼠分为模型对照组（OVX）、南极磷虾油组（AKO，150 mg/kg）、鱼油组（FO，80 mg/kg）、花生四烯酸油组（AAO，140 mg/kg）。假手术组和模型对照组灌胃生理盐水，其余各组按照南极磷虾油和鱼油中DHA、EPA总含量相等且与花生四烯酸含量相等的原则，灌胃相应剂量的受试物，灌胃体积为10 mL/kg。受试物干预12 周，末次给药，禁食不禁水，称体质量，小鼠摘眼球取血后处死，收集血清离心取上清用于后续TC、TG浓度测定。迅速剥离左右股骨置于10%中性甲醛溶液中固定，用于骨强度（骨密度、生物力学性能）测定及骨组织形态学观察。剥离腹腔白色脂肪称质量，体脂比按下式计算。取肝脏称总质量并取部分肝脏于10%中性甲醛溶液中固定，将剩余肝脏包锡箔纸，放入液氮，于-20 ℃保存，用于后续TC、TG浓度测定。

1.3.2 骨密度测定

使用双能X射线骨密度仪在小动物模式（电流150 mA、电压76 kV）下进行股骨骨密度测定。

1.3.3 生物力学性能测定

使用YLS-16A小动物骨骼强度测定仪测定股骨骨折断力。

1.3.4 骨组织形态学观察

股骨于10%中性甲醛溶液固定24 h，并于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液中脱钙2 周后，进行石蜡切片（厚度7 μm）。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后于显微镜下观察并拍照。并利用Image J软件对相应参数进行分析，具体包括骨小梁厚度、骨小梁分离度和脂肪细胞数目。

1.3.5 肝脏组织形态学观察

肝脏于10%中性甲醛溶液固定，流水冲洗12 h，利用梯度乙醇脱水后，石蜡包埋切片（厚度6 μm），进行HE染色，置于显微镜下观察各组组织形态。

1.3.6 血清及肝脏中TC、TG水平的测定

按照试剂盒说明书要求，测定小鼠血清及肝脏中TC和TG的水平。

1.3.7 肝脏脂质合成关键基因相对表达量测定

按照总RNA抽提试剂盒说明书提取肝脏组织mRNA，利用实时荧光定量PCR仪测定小鼠肝脏中脂质合成相关基因、、、的mRNA相对表达量。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，扩增45 个循环。以作为内参基因。目的基因引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes

1.4 数据处理与分析

所有数据均以平均值±标准差表示，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）法进行组间差异比较，＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 AKO、FO和AAO对OVX模型小鼠体质量和白色脂肪质量的影响

如图1所示，与Sham组相比，OVX组小鼠体质量增加量极显著升高（＜0.01），且腹腔白色脂肪质量与体脂比也极显著升高（＜0.01）。与OVX组相比，经AKO与FO干预后，小鼠体质量增加量极显著降低，白色脂肪组织质量及体脂比极显著降低；而灌胃AAO组小鼠体质量增加量升高了18.74%，白色脂肪质量及体脂比均未发生明显变化。结果表明两种-3 PUFA均能显著抑制去卵巢骨质疏松小鼠体内脂肪累积，改善绝经后肥胖，AKO效果优于FO；而-6 PUFA AAO无此作用。

图1 AKO、FO和AAO对OVX小鼠体质量增加量（A）、白色脂肪质量（B）及体脂比（C）的影响Fig. 1 Effects of AKO, FO and AAO on body mass gain (A), white adipose tissue mass (B) and body fat percentage (C) in OVX mice

2.2 AKO、FO和AAO对OVX模型小鼠骨强度的影响

骨密度是衡量骨骼强度的一个黄金指标，与骨强度呈正相关。Byrne等利用骨密度评判骨质疏松症患者骨折预后的情况。如图2A所示，相比于Sham组，OVX组小鼠骨密度显著降低（＜0.05）。与OVX组相比，经AKO与FO干预后，小鼠骨密度均不同程度地升高，AKO组升高了7.14%（＜0.01），FO组升高了2.78%（＜0.05）；AAO灌胃后小鼠骨密度则极显著下降（＜0.01）。同时图2B显示，与OVX组相比，经AKO与FO干预后，小鼠骨骼的生物力学性能得到不同程度的改善，骨折断力增加，说明抵抗骨折断的能力增强，而AAO干预则呈现相反的效果。结果表明，两种-3 PUFA均可提高去卵巢小鼠骨强度及生物力学性能，且AKO效果优于FO；而-6 PUFA AAO则降低OVX小鼠骨密度与骨骼生物力学性能。

图2 AKO、FO和AAO对OVX小鼠骨密度（A）与骨折断力（B）的影响Fig. 2 Effects of AKO, FO and AAO on bone mineral density (A) and fracture (B) in OVX mice

2.3 AKO、FO和AAO对OVX模型小鼠骨组织形态学的影响

骨组织形态学能够直观地反映骨微结构与骨髓腔脂肪细胞数目的情况。如图3、4所示，OVX组出现了严重的骨微结构破坏，提示骨质疏松症的发生；经AKO干预后，OVX小鼠骨小梁显著变厚，连续性变好；而AAO干预会进一步破坏OVX小鼠骨微结构。经去卵巢手术后，相比于Sham组，OVX组脂肪细胞数目极显著增加（＜0.01）。与OVX组相比，AKO与FO干预后脂肪细胞数目极显著减少，而AAO干预后脂肪细胞数目更多，严重破坏了骨微结构。结果表明，两种-3 PUFA均可改善骨质疏松导致的骨微结构损伤，并减少骨髓腔中的脂肪积累，且AKO干预效果优于FO；而-6 PUFA AAO则会增加骨髓腔中的脂肪细胞数目，加剧脂质代谢紊乱。

图3 AKO、FO和AAO对OVX小鼠骨组织形态的影响（×200）Fig. 3 Effects of AKO, FO and AAO on bone morphology in OVX mice (× 200)

图4 AKO、FO和AAO对OVX小鼠脂肪细胞数量（A）、骨小梁厚度（B）及骨小梁分离度（C）的影响Fig. 4 Effects of AKO, FO and AAO on adipocyte number (A),trabecular thickness (B) and trabecular separation (C) in OVX mice

2.4 AKO、FO和AAO对OVX模型小鼠肝脏的影响

不同组别的肝体比（肝脏质量/体质量）无明显差异（图5A），然而，肝脏组织学结果显示，与Sham组相比，OVX组小鼠肝脏细胞胞质中出现明显的白色脂滴空泡（图5B）；经AKO与FO干预后，肝脏细胞排列整齐、界限分明，脂滴在细胞质中消失，无明显的脂肪变性，且AKO组肝脏细胞形态更接近Sham组；而经AAO干预后，小鼠肝脏细胞排列散乱，细胞中脂滴空泡增加，肝脏脂质积累。表明两种-3 PUFA可改善骨质疏松导致的肝脏脂质积累，且AKO干预效果优于FO；而-6 PUFA AAO则进一步加剧脂质代谢紊乱，促进肝脏脂质积累。

图5 AKO、FO和AAO对OVX小鼠肝体比（A）、肝脏组织形态学（B）的影响（×200）Fig. 5 Effects of AKO, FO and AAO on hepatosomatic index (A) and hepatic histomorphology (B) in OVX mice (× 200)

2.5 AKO、FO和AAO对OVX模型小鼠血清及肝脏脂质水平的影响

血清及肝脏中TC、TG的浓度是反映机体脂质水平的重要指标。如图6A所示，相比于Sham组，OVX组血清中TC、TG浓度均显著升高。与OVX组相比，经AKO或FO灌胃后，AKO组血清TC、TG浓度分别显著下降了9.77%（＜0.01）和11.54%（＜0.05），FO组血清中TC、TG浓度未发生显著变化；经AAO干预后，血清中TC、TG浓度分别升高了18.55%（＜0.01）和15.14%（＜0.05）。由图6B可知，与OVX组相比，经AKO与FO干预后，肝脏TC、TG含量也较OVX组下降，而AAO干预后则呈升高的趋势。提示两种-3 PUFA均能抑制OVX小鼠血脂及肝脏脂质水平的升高，且AKO效果更为显著；而-6 PUFA AAO则促进脂质水平的上升。

图6 AKO、FO和AAO对OVX小鼠血清（A）及肝脏（B）中TC、TG水平的影响Fig. 6 Effects of AKO, FO and AAO on TC and TG levels in the serum (A) and liver (B) of OVX mice

2.6 AKO、FO和AAO对OVX模型肝脏脂质合成关键基因的影响

由图7可知，与Sham组相比，OVX组小鼠肝脏中、、和的mRNA表达水平极显著升高，表明去卵巢小鼠肝脏中脂质合成增加；与OVX组相比，经AKO及FO干预后，小鼠肝脏中脂质合成关键基因表达水平显著或极显著下降，其中AKO效果整体上更佳；而灌胃AAO后，上述基因表达水平均不同程度提高，与OVX组相比，、、和的mRNA表达水平分别升高了31.85%、21.12%、40.71%、18.35%。表明两种-3 PUFA均有抑制脂质合成的作用，且AKO效果优于FO；而-6 PUFA AAO则加速了脂质在肝脏中的合成。

图7 AKO、FO和AAO对OVX小鼠肝脏中脂质合成关键基因mRNA表达水平的影响Fig. 7 Effects of AKO, FO and AAO on the mRNA expression of lipid synthesis-related genes in OVX mice

3 讨 论

本实验采用双侧去卵巢手术建立绝经后骨质疏松模型，比较了AKO、FO和AAO 3 种PUFA油脂对骨质疏松模型小鼠脂质水平的影响，提示3 PUFA能够改善骨质疏松引起的脂质积累，且磷脂型PUFA优于乙酯型PUFA，即AKO效果优于FO；而-6 PUFA AAO则进一步加剧了骨质疏松小鼠体内的脂质代谢紊乱。

绝经后骨质疏松症是最为常见的一种骨质疏松症，诱发原因是体内雌激素水平降低。绝经后骨质疏松患者常伴有肥胖与白色脂肪组织的过度积累，骨骼强度下降的同时伴随着骨髓腔脂肪细胞数量增多，成骨细胞数量减少；增加的脂肪组织又会通过释放炎症因子来影响骨代谢。本研究中，相比于正常小鼠，OVX小鼠体质量明显上升，腹腔脂肪组织增多，骨髓腔中脂肪细胞数目是Sham组的2 倍多。Cho等通过全基因组关联研究证明了骨质疏松与肥胖之间密切的联系。类似地，采用双侧卵巢切除建立骨质疏松小鼠模型，通过脂质组学分析发现，小鼠股骨骨质疏松症的发生与脂质的许多变化有关，包括脂酰、甘油、甘油磷脂、鞘脂和固醇，表明骨质疏松症确实诱发了脂代谢紊乱。因此，骨质疏松与脂质代谢密不可分，骨质疏松的发生导致体内脂质代谢紊乱，研究骨质疏松模型中脂质代谢问题具有重要意义。

南极磷虾油含有丰富的磷脂型-3 PUFA，如磷脂型EPA和磷脂型DHA，有助于改善软骨结构，抑制软骨细胞肥大分化及关节软骨异常凋亡。相比于高脂饲料喂养的小鼠，添加AKO喂养的小鼠血脂异常得到改善，并能够显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇含量，从而改善肥胖。本实验中，AKO的摄入明显改善了去卵巢导致的骨质疏松，进一步减少了肝脏、血清中的脂质积累。乙酯型FO能够通过激活软骨细胞自噬进程来抑制骨性关节炎小鼠的软骨退变进程。同时，研究发现超重和肥胖成人补充乙酯型-3 PUFA，可改善其血脂异常和胰岛素抵抗，并改变脂蛋白的脂肪酸组成。本研究使用乙酯型FO缓解了骨质疏松小鼠骨强度的降低；同时这种乙酯型PUFA油脂减少了骨髓腔中脂肪细胞的数目，改善了OVX小鼠的血脂异常。分子形式的不同可能影响DHA和EPA在体内的吸收和代谢。磷脂形式可使血液中的DHA与EPA维持在较高浓度，而乙酯型的生物利用率低且消化吸收困难。不同分子形式的DHA、EPA的结构特点可能决定了它们不同的生理功能。

综上所述，摄入-3 PUFA能够改善绝经后骨质疏松症导致的脂质积累，并且磷脂型DHA、EPA效果优于乙酯型DHA、EPA；而-6 PUFA的摄入会加剧脂质代谢紊乱，提升骨质疏松患者疾病加重的风险。