表达鼠源β-防御素14的植物乳植杆菌减轻小鼠急性结肠炎

陈小培，田海芝，任正楠，潘礼龙，孙 嘉,*

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是特发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn’s disease）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）。近年来，该疾病的发病率迅速上升，其全球发病率超过0.3%。除遗传因素外，环境因素在IBD的发病机制中起着关键作用，大多数环境因素主要通过影响肠道菌群从而介导IBD的发病过程，如西方饮食的长期摄入会破坏肠道菌群平衡，降低菌群多样性，肠道菌群及其代谢产物刺激先天免疫细胞的激活，引起肠道炎症反应的发生，从而损伤肠道上皮屏障，导致细菌易位，并进一步刺激炎症反应发生，加速IBD的发生发展。目前IBD的临床治疗药物主要为氨基水杨酸盐、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂，然而这些药物可能会引起机会性感染或不良并发症等副作用。肠道菌群对于IBD发病至关重要，临床患者体内会出现以大肠杆菌为主的致病性细菌异常富集。目前，益生菌的使用已成为IBD防治研究的重点方向之一。基于肠道菌群和炎症反应在IBD发病中的重要作用，亟待开发既能调节肠道菌群，又能抑制炎症反应的治疗方案。

抗菌肽又名宿主防御肽，是生物体先天性防御系统中的重要组成成分，存在于大多数生物体中。新近研究表明，除维持宿主体内的肠道菌群稳态功能以外，部分抗菌肽还具有免疫调节作用。临床数据已发现，IBD患者体内抗菌肽（如防御素、导管素和c型凝集素）分泌不足可导致肠道内生态失调和黏膜屏障损伤。-防御素是脊椎动物特有的防御素之一，主要表达于上皮细胞，人源防御素3（human-defensin 3，hBD3）为防御素家族中抗菌效果最强的抗菌肽，其抑炎作用已在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所诱发的炎症反应中被证实。

在针对UC的临床试验中，可分泌hBD2的益生菌大肠杆菌Nissle1917表现出与药物美沙拉嗪相当的疗效和安全性。然而，相比hBD2，抗菌效果更强且具有抗炎能力的hBD3在IBD中的作用及其对肠道菌群的影响仍有待挖掘。由于抗菌肽对酸性环境十分敏感，若直接口服-防御素，胃酸可能会破坏其抑菌活性。植物乳植杆菌（）是国家卫生部《可食用的菌种名单》中列出的益生菌之一，被广泛应用于肠道炎症的干预研究，其可黏附在肠道黏膜上并存活数天，是表达生物活性物质的良好载体。故本实验选取植物乳植杆菌为载体构建重组菌株，通过Usp45分泌信号驱动hBD3直系同源蛋白鼠源-防御素14（mouse-defensin 14，mBD14）的分泌，实现mBD14在小鼠结肠中的靶向递送。本研究旨在揭示表达mBD14的重组植物乳植杆菌在葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium，DSS）诱发的小鼠结肠炎中的作用及其潜在机制，评估益生菌和抗菌肽在UC中的作用，为IBD防治提供新策略。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性BALB/c小鼠，6～8 周龄，体质量为（20±2）g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司（生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008），饲养于江南大学实验动物中心。

植物乳植杆菌来自江南大学食品微生物学培养物保藏中心。

DSS、SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-Dextran）德国Merck KGaA公司；FastDNA粪便DNA提取试剂盒安倍医疗器械贸易（上海）有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）引物 上海生工公司；-actin抗体 武汉爱博泰克生物科技有限公司；Claudin-1抗体、Cleaved-白细胞介素（interleukin，IL）-18抗体 英国Abcam公司；Occludin抗体 美国Bimake公司；ZO-2抗体 美国Proteintech公司；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗体、Cleaved-IL-1β抗体 美国Cell Signaling Technology公司；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）抗体 美国HuaBio公司；Caspase-1 p20抗体 美国Santa Cruz Biotechnology公司；mBD14抗体 美国MyBioSource公司。

1.2 仪器与设备

ST40R冷冻离心机、MULTISKAN GO全波长酶标仪美国Thermo Fisher Scientific公司；1150H组织石蜡包埋机、PM2245手动轮转切片机 德国莱卡公司；Pannoramic MIDI切片电子扫描仪 匈牙利3DHISTECH公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨机 宁波新芝生物科技股份有限公司；qPCR仪、ChemiDoc Touch凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 重组菌株的构建及鉴定

采用基因工程技术将含有Usp45分泌信号肽、连接体Linker和基因序列的融合基因（）克隆到pNZ8148质粒中得到重组质粒，然后将其电转化到植物乳植杆菌感受态细胞中后进行培养，得到的阳性克隆体，命名为/pNZ8148-mBD14（/mBD14）。将携带空载pNZ8148质粒的菌株命名为/pNZ8148（/0）。重组植物乳植杆菌菌株培养于MRS液体培养基中至OD为0.4～0.6获得重组菌株菌液，对重组菌株菌液进行质粒抽提，并通过PCR检测进行验证。将重组菌株在含有溶菌酶（质量浓度1 g/L）的MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培养基中培养（30 ℃、1 h），吸取部分菌液在室温下离心（12 000×、15 min），分离出的上清液为分泌蛋白，菌体沉淀用2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬并超声破碎，再次离心（12 000×、15 min）获得的上清液即为菌内蛋白。

1.3.2 牛津杯法抑菌实验

在实验前对MRS琼脂培养基进行高温灭菌，冷却到适宜温度后加入植物乳植杆菌，随后倒在培养皿内，待其凝固后在培养皿表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压使牛津杯与培养基无空隙接触，在杯中分别加入质量分数5.24% MRS培养基、质量浓度5 ng/mL氯霉素和/mBD14上清液，置于30 ℃培养箱中培养16～18 h后，观察牛津杯周围有无抑菌圈生成，判断mBD14是否会影响植物乳杆菌的生长。

1.3.3 动物模型构建

全部动物实验均由江南大学动物伦理委员会批准（JN.141 No2020930b0481108），并遵循国家、国际动物实验伦理原则开展。将BALB/c小鼠随机分为正常组（Control）、模型组（DSS）、预处理组（DSS+）、/0预处理组（DSS+/0）和/mBD14预处理组（DSS+/mBD14），每组6～8 只。动物干预实验为期15 d，在实验的前7 d，每天通过灌胃分别给予正常组和模型组每只小鼠200 μL PBS，预处理组每只小鼠200 μL实验菌悬液（2×10CFU）；第8天，所有小鼠正常饮水；随后7 d，模型组和预处理组的小鼠通过自由摄入含有质量分数3% DSS的饮用水诱导结肠炎。在实验的第15天，使用质量分数1%异氟烷麻醉小鼠，快速收集血液后颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠组织、血清及肠道内容物等样品保存于-80 ℃冰箱中用于后续检测。

1.3.4 炎症严重程度评估

通过疾病活动指数（disease activity index，DAI）和结肠长度综合评估小鼠结肠炎的严重程度。在DSS诱导期间，每日观察所有小鼠的身体状况并以分数形式记录，主要包括3 个指标：体质量减轻率（0：0%；1：1%～5%；2：5%～10%；3：＞10%）、粪便稠度（0：正常；1：软而结实；2：较软；3：腹泻）和直肠出血情况（0：正常；1：粪便隐血阳性；2：隐血阳性及可见颗粒性出血；3：肛门周围出血），3 个指标的总和即DAI评分。动物处理结束后，收集每只小鼠的结肠并测量其长度。

1.3.5 组织病理学检测

新鲜的结肠远端组织在质量分数4%多聚甲醛溶液中避光固定24～36 h后，经过脱水和石蜡包埋获得包有组织的蜡块，随后将其切成厚度为5 μm的组织切片并使用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色法对切片进行处理。待贴有组织切片的载玻片风干后，在显微镜下观察小鼠结肠组织病理变化，并使用扫描仪拍摄高分辨率切片图像。对于组织学评分，本实验使用的评分系统如下：隐窝结构破坏程度（0：正常；2：＜50%；4：50%～90%；6：＞90%），黏膜水肿程度（0：正常；2：轻度水肿；4：中度水肿；6：严重水肿），炎症范围（0：无炎症；2：＜10%；4：10%～50%；6：＞50%）。组织学评分即为3 项指标之和。

1.3.6 qPCR分析

采用TRIzol法提取小鼠结肠中的总RNA，首先称取适量的结肠组织加入1 mL TRIzol，将其置于高通量组织研磨机中快速破碎，随后加入三氯甲烷进行抽提，离心（12 000×、4 ℃、10 min）后吸取上清液并加入等体积的异丙醇，再次离心得到絮状白色RNA沉淀，用体积分数75%乙醇溶液（无酶去离子水配制）清洗两次沉淀，待残留乙醇挥发后用无酶去离子水将沉淀溶解。使用EasyQuick RT MasterMix逆转录试剂将总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，-actin为内参，Fast SYBR Green Master Mix混合体系，进行qPCR实验，反应总体系为20 μL，包括SYBR Green Supermix染料（10 μL）、无菌去离子水（7 μL）、正向序列引物（0.5 μL）、反向序列引物（0.5 μL）和cDNA（2 μL）。扩增程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，反应40 个循环。按照2法计算目的基因（、、、和）相对内参基因（）的表达变化。本实验使用的引物如表1所示。

表1 qPCR使用的特异性引物Table 1 Specific primers used for qPCR

1.3.7 肠道通透性的测定

本实验使用荧光示踪剂FITC-Dextran来检测小鼠的肠道通透性。在准备解剖小鼠前，对小鼠进行禁食处理，同时给每只小鼠灌胃500 mg/kg的FITC-Dextran，灌胃4 h后眼球取血法收集血液，将其置于避光处静置一定时间后离心得到血清。使用酶标仪在激发波长492 nm和发射波长525 nm的条件下测定各个样本的吸光度。通过梯度稀释FITC-Dextran溶液绘制标准曲线，并根据标准曲线方程换算出血清中的FITC-Dextran质量浓度。

1.3.8 免疫印迹实验

称取适量的结肠组织于离心管中，加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液并在低温条件下进行组织破碎，经过两次离心（14 000×、4 ℃、15 min）后得到清澈的蛋白溶液，吸取少量蛋白溶液用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，其余蛋白溶液与上样缓冲液混合。设置样本的蛋白上样量为30 μg，根据蛋白质量浓度计算出各个样本的上样体积。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品后，待蓝色指示条带到达胶的底部时停止电泳，将蛋白电转印到硝酸纤维素膜上，用质量分数5%的脱脂乳溶液封闭结束后，分别用ZO-2、Occludin、Claudin-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、Cleaved-IL-18和Cleaved-IL-1β蛋白的抗体4 ℃孵育过夜，然后用对应的辣根过氧化物酶偶联抗体室温孵育2 h，显色液孵育数秒后置于Bio-Rad凝胶成像系统中曝光观察。采用Image Lab软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以-actin为内参蛋白，归一化处理后确定各个蛋白的表达情况。

1.3.9 结肠内容物DNA提取及细菌定量

在解剖小鼠时，收集所有小鼠的结肠内容物样品并保存到-80 ℃冰箱中。取适量样品，使用粪便DNA提取试剂盒提取小鼠结肠内容物中的DNA，通过qPCR检测结肠内容物中嗜黏蛋白阿克曼菌（）、大肠杆菌（）、具核梭杆菌（）和金黄色葡萄球菌（）相对于总细菌（16S rDNA）的表达量。引物序列如表1所示。

1.4 数据处理与分析

数据以平均值±标准差表示。单因素方差分析和双因素方差分析用于评估各组间的显著性差异，＜0.05被视为具有统计学意义。所有数据均在GraphPad Prism V.8.0.2软件中进行分析。

2 结果与分析

2.1 mBD14生产菌L. plantarum/mBD14的构建及mBD14的表达

将抗菌肽基因编码的蛋白序列与信号肽序列进行融合，使抗菌肽以融合蛋白从益生菌中自然分泌，是利用益生菌载体传递抗菌肽到肠道环境的有效策略。本实验选择Usp45作为分泌信号肽，Usp45与外源蛋白序列或肽连接时可促进它们分泌到胞外。融合基因经限制性内切酶酶切后嵌入pNZ8148质粒的I和I位点，得到质粒pNZ8148-mBD14，将该质粒电转入植物乳植杆菌感受态细胞中得到/mBD14（图1A）。在含有氯霉素（质量浓度5 μg/L）的MRS固体培养基上涂布菌液，培养后得到的单菌落即阳性转化子（图1B）。挑取单个菌落，经培养后提取质粒，通过PCR检测mBD14基因片段的表达，可见大小约382 bp的扩增条带，与含融合基因的穿刺菌质粒PCR结果一致（图1C）。同时，Western blot和抑菌圈实验表明/mBD14能够表达和分泌mBD14蛋白，且mBD14蛋白不会影响其载体植物乳植杆菌的生长（图1D、E）。

图1 L. plantarum/mBD14的构建及mBD14的表达Fig. 1 Construction of L. plantarum/mBD14 and expression of mBD14

2.2 L. plantarum/mBD14对小鼠结肠炎症状的缓解作用

在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，典型的表观指标包括腹泻、便血和体质量减轻。用DSS处理小鼠7 d后，观察到与Control组相比，未进行细菌预处理的DSS组小鼠体质量显著下降（图2A），DAI评分显著增加（图2B）。结肠缩短也是小鼠结肠炎模型的关键病理事件之一。对所有小鼠解剖后测量其结肠长度，发现DSS组小鼠的结肠明显变短，进一步证明小鼠结肠炎模型建立成功。在诱导结肠炎前，分别给予小鼠、/0和/mBD14进行预处理，结果显示，与DSS组相比，/mBD14能够显著改善体质量的减轻（＜0.05），降低DAI评分和缓解结肠缩短，而摄入和/0的小鼠与DSS组小鼠相比，DAI评分和结肠长度未表现出明显差异（图2B、C）。实验结果表明/mBD14能够缓解由DSS诱导的结肠炎，而两种对照菌株无明显保护作用。

图2 L. plantarum/mBD14对缓解小鼠急性结肠炎症状的影响Fig. 2 L. plantarum/mBD14 alleviates the symptoms of acute colitis in mice

2.3 L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠肠道菌群的调节作用

利用qPCR检测小鼠结肠内容物中嗜黏蛋白阿克曼菌、大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌的相对丰度，结果如图3所示，小鼠经过DSS处理后，结肠内致病菌大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌相对丰度显著增加（＜0.001、＜0.05、＜0.01），下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著降低（＜0.05），与临床上IBD患者的变化一致。相比于DSS组，/mBD14预处理组小鼠结肠内嗜黏蛋白阿克曼菌相对丰度显著升高（＜0.05），而大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌相对丰度出现显著下降趋势（＜0.001、＜0.05、＜0.01），其相对丰度均接近于Control组，且和/0预处理能够显著抑制大肠杆菌和具核梭杆菌的增加（＜0.001、＜0.05）。本实验表明/mBD14能够显著抑制DSS诱导的多种致病性细菌富集，维持小鼠结肠内肠道菌群平衡。

图3 L. plantarum/mBD14对调节结肠炎小鼠的肠道菌群相对丰度的影响Fig. 3 L. plantarum/mBD14 regulates the gut microbiota in mice with acute colitis

2.4 L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠肠道损伤的保护作用

通过H&E染色对小鼠结肠组织进行组织病理学分析，发现DSS组表现出严重的结肠组织损伤，其隐窝结构明显消失，结肠组织周围水肿，免疫细胞浸润，且DSS处理小鼠的组织病理学评分均高度显著高于Control组（＜0.001）。经/mBD14预处理小鼠的结肠组织切片有明显改善，可见其结肠形态变化和炎症浸润减少（图4A），且组织学评分在所有摄入DSS的处理组中最低（图4B）。此外，有研究表明，DSS诱导的结肠炎会带来肠道屏障功能的损伤，并出现肠道通透性增加、紧密连接蛋白表达下调等现象。通过检测小鼠血清中FITC-Dextran的质量浓度来评估小鼠的肠道通透性。如图4C所示，与Control组相比，DSS组小鼠血清中FITC-Dextran质量浓度显著升高（＜0.05），而/mBD14预处理组与DSS组相比FITC-Dextran质量浓度显著降低（＜0.05），表明/mBD14能够维持肠道完整性，使FITC-Dextran无法渗透进入血液。紧密连接蛋白在维持肠屏障功能中发挥着关键作用，通过Western blot检测紧密连接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表达情况来进一步验证/mBD14对肠道屏障功能的保护作用。如图4D所示，与DSS组相比，/mBD14能够显著提高紧密连接蛋白的表达量（＜0.05），而其他两种对照菌株未表现出明显的效果。综上，/mBD14预处理能够改善DSS诱导的肠道屏障。

图4 L. plantarum/mBD14保护结肠炎小鼠肠道屏障功能Fig. 4 L. plantarum/mBD14 protects intestinal barrier function in mice with acute colitis

2.5 L. plantarum/mBD14对结肠炎小鼠的免疫调节作用

DSS直接作用于结肠上皮，可损伤肠道屏障，导致肠道内细菌及其代谢物扩散到黏膜下层组织，从而诱导免疫细胞的激活和细胞因子的产生，引发肠道炎症反应。利用qPCR检测小鼠结肠内促炎性细胞因子、、、和基因表达情况，结果如图5所示，在DSS组小鼠中这些促炎性细胞因子的基因表达水平高度显著升高（＜0.001）。而/mBD14预处理显著降低了促炎性细胞因子的表达（＜0.01、＜0.001）。同时和在和/0预处理组的表达量也显著下调（＜0.05、＜0.01）。而和的过度表达在IBD发病机制中起重要作用，本实验已在mRNA水平上检测到和的显著变化。有研究表明在IBD患者和小鼠急性结肠炎中，NLRP3被激活，与接头分子ASC和Caspase-1形成炎症小体复合体，导致Caspase-1的激活，促进pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成活性的IL-1β和IL-18。采用Western blot检测发现DSS组小鼠结肠内剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表达量极显著升高（＜0.01），而/mBD14预处理使剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表达极显著抑制（＜0.01），进一步检测其上游通路NLRP3炎症小体的表达情况，结果显示，与DSS组小鼠相比，/mBD14显著抑制了NLRP3及其下游ASC和Caspase-1的蛋白表达（＜0.01、＜0.05），而或/0均未产生抑制作用（图5F）。综上，/mBD14抑制DSS诱导的NLRP3炎症小体及下游炎症通路的激活，减少IL-1β和IL-18的分泌，进而缓解结肠炎症。

图5 L. plantarum/mBD14抑制结肠炎小鼠的肠道炎症反应Fig. 5 L. plantarum/mBD14 inhibits the intestinal inflammatory responses in mice with acute colitis

3 讨 论

IBD患者肠道内存在严重菌群失调，其肠道微生物多样性明显低于健康人群。在UC患者中发现嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度降低，可能是由于结肠黏蛋白的减少。大肠杆菌被认为是IBD的潜在病原体，特别是黏附侵袭性大肠杆菌的某些菌株，在IBD患者中显著升高。此外，从UC患者体内分离出一种高侵入性菌株——具核梭杆菌，该菌株的丰度与UC的发展呈正相关。金黄色葡萄球菌在IBD患者的肠淋巴滤泡中发现，可能与患者发生感染有关。在本研究所构建的小鼠急性结肠炎模型中，小鼠结肠内嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度显著降低，而大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌的丰度显著升高，这些变化均与UC患者体内变化一致。Mergaert等的研究表明抗菌肽在维持肠道生态平衡方面起重要作用。本实验发现/mBD14预处理能够抑制致病菌大肠杆菌、具核梭杆菌和金黄色葡萄球菌的扩散及益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌的消耗，表明/mBD14能够有效缓解结肠炎发病过程中肠道菌群紊乱的现象。

肠道屏障的破坏会加剧肠道细菌易位，导致肠道黏膜免疫系统识别细菌抗原并产生过激的免疫反应，是IBD的核心病理特征。肠道屏障功能障碍发生于IBD的早期阶段，主要表现为肠道紧密连接功能和蛋白组成的改变。在体外细胞实验中已报道，hBD3可增强多种紧密连接蛋白的表达。本实验在小鼠体内研究发现，/mBD14通过上调紧密连接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表达抑制DSS诱导的肠道通透性增加，维持屏障功能。同时，在结肠炎动物模型和IBD患者中，活化的免疫细胞产生多种促炎性细胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A和IL-18等，造成肠道炎症损伤。IL-1家族细胞因子IL-1β和IL-18由单核巨噬细胞（mononuclear macrophages，MNPs）和肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）产生，在肠道炎症中具有促炎效应；IL-1β通过诱导可分泌IL-17A的先天淋巴样细胞（innate lymphoid cells，ILCs）和辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞激活来促进肠道炎症；IL-18在结肠炎中通过调控杯状细胞发育的转录程序来抑制杯状细胞成熟，导致肠道黏膜屏障的破坏。IL-6由肠道中的多种免疫细胞（如MNPs、IECs和Th2细胞等）产生，可通过激活IL-6信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）通路来增加促炎细胞因子的产生和防止T细胞凋亡。由MNPs产生的IL-12可诱导Th1细胞的分化，促进干扰素（interferon，IFN）-γ的分泌。在本实验的结肠炎模型中，结肠内、、、和的mRNA相对表达量均显著升高。细菌预处理组中/mBD14能够显著抑制结肠内这些促炎性细胞因子的表达，和/0对和也具有显著抑制作用，可能是由于植物乳植杆菌作为益生菌在小鼠急性结肠炎中产生有益作用。

NLRP3炎症小体的形成对IL-1家族细胞因子的产生至关重要。由微生物诱导的NLRP3炎症小体的激活已在IBD患者和小鼠急性结肠炎中被证实。免疫细胞中的NLRP3可感知各种微生物及其代谢物产物。在UC患者中，共生体免疫球蛋白G作用于表达肠道驻留受体FcγR的MNPs，诱导NLRP3炎症小体的激活和IL-1β的产生。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，奇异变形杆菌的细菌毒素溶血素刺激单核细胞内NLRP3，诱导IL-1β的释放。此外，大肠杆菌在IBD患者肠道中富集并通过激活NLRP3炎症小体来促进IL-1β的产生。这些研究表明肠道细菌可调节NLRP3炎症小体的活性。本实验发现/mBD14预处理可显著抑制NLRP3炎症小体及其下游炎症通路的激活，这可能与/mBD14可降低致病菌（如大肠杆菌）在结肠中异常富集有关。

工程益生菌的应用可实现抗菌肽在肠道中的靶向递送，其中乳酸菌已成功用作细菌载体，利用重组技术表达抗菌肽（如表达鼠源导管素相关抗菌肽的乳酸乳球菌NZ9000）可预防小鼠自身免疫性糖尿病和结肠炎的发展，本实验中表达mBD14的植物乳植杆菌可缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，表明工程益生菌在改善人类健康方面具有潜在应用价值。

4 结 论

本实验构建了具有Usp45分泌序列的重组菌株，即表达mBD14的植物乳植杆菌/mBD14，实现了mBD14在肠道中的靶向递送。用/mBD14对DSS诱导的结肠炎小鼠进行预处理，可明显缓解结肠炎症状。同时，/mBD14能够调节肠道菌群，维持肠道屏障完整性，减少促炎性因子的表达，抑制NLRP3炎症小体及下游炎症通路的激活，进而减轻炎症反应。这一策略可促进益生菌和抗菌肽对于IBD的临床应用。