高通量测序比较分析被咬犬伤口及其周边皮肤的菌群特征

关 珊 ， 王少林 ， 吴聪明

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中农大动物医院有限公司，北京 海淀 100193)

宠物犬户外活动时经常发生斗殴，易导致咬伤。犬被咬伤口的菌群特征国内未见相关研究，国外报道也极少，仅见常规分菌方法获得的调查结果。咬伤伤口厌氧菌与需氧菌混合存在，与其他伤口大部分由需氧菌组成不同[1-3]。本试验应用16S rDNA高通量测序技术[4]比较分析犬咬伤周边皮肤和咬伤伤口的菌群，旨在更全面地了解咬伤伤口菌群组成与影响因素，为临床治疗宠物犬咬伤时合理选用抗菌药物提供理论依据，以提高药物的有效性和治愈率。

1 材料与方法

1.1 试验对象 选取2019年6月—11月来中国农业大学动物医院就诊的10只咬伤犬。就诊前伤口均未进行消毒、清洗或用药，且伤犬1个月内未使用过抗菌药物或微生态制剂。

1.2 试验方法

1.2.1 采样方法 采样时用生理盐水清洗伤口处污物，使用ESwabTM管的尼龙绒头分别在伤口(伤口样品)和周围2～3 cm内的皮肤(皮肤样品)反复擦拭。将采集样品用冰袋保存，尽快送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析。参与试验的伤犬主人均知晓采样目的并同意参与试验。

1.2.2 样品分析 采用16S rDNA测序分析伤口样品和皮肤样品的菌群结构。测序流程包括样品基因组DNA提取与质检、16S rDNA可变区扩增与测序文库构建、高通量测序等，每个环节均进行严格质控。对每个样品测序原始数据进行去接头和低质量过滤处理，然后去除嵌合体序列，得到有效序列后进行聚类分析，每一个聚类称为一个物种操作单元(Operational taxonomic units，OTU)，对OTU的代表序列作分类学分析，得到各样品的物种分布信息。

1.3 多样性分析 基于OTU分析结果，对各个样品进行α多样性指数分析，得到各样品物种丰富度和均匀度信息等；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构统计分析；通过计算UniFrac距离、绘制PCoA图等，展示不同样品或两类样品之间的菌群结构。最后通过Anosim分析和Metastats差异分析，得到样品之间的菌群结构差异性。

2 结果

2.1 OTU聚类分析 利用Qiime(1.9.1)和Vsearch(1.9.6)软件在97%的相似水平下对10只咬伤犬的伤口样品(10个)和伤口周边皮肤样品(10个)的细菌16S rDNA测序得到的每条序列进行OTU聚类分析，制作Venn图。结果如图1所示，皮肤样品和咬伤样品之间高相似度的OTU有280个，分别占皮肤样品和咬伤样品OUT的90.6%和99.3%。

图1 皮肤和咬伤样品细菌16S rDNA测序OUT数目的Venn图Fig.1 Venn diagram of bacterial 16S rDNA sequencing OUT number of skin and bite samples

2.2 物种注释 依据高通量测序获得的序列信息，在门水平和属水平上分析两类样品的菌群组成和相对丰度，结果见图2。

根据相对丰度将样品中的菌门、属分为优势菌门、属(相对丰度≥1.0%)和次要菌门、属(相对丰度<1.0%)，且将次要菌门、属归类于其他[5]。在菌门水平上选取两类样品最大相对丰度排名前14位的物种制作相对丰度分布柱形图(图2A)，结果发现：皮肤样品的优势菌门依序为变形菌门(44.5%)、厚壁菌门(35.2%)、拟杆菌门(12.3%)、梭杆菌门(3.3%)、放线菌门(2.6%)和Patescibacteria(1.2%)，其余为次要菌门；咬伤样品的优势菌门依序为变形菌门(57.1%)、厚壁菌门(20.0%)、拟杆菌门(16.1%)、放线菌门(4.6%)和梭杆菌门(2.0%)，其余为次要菌门。其中，变形菌门的相对丰度在皮肤样品和咬伤样品中均最高。

图2 基于16S rDNA测序获得的皮肤和咬伤样品菌群组成和相对丰度Fig.2 Bacterial composition and relative abundance of skin and bite samples based on 16S rDNA sequencingA:菌门水平; B.菌属水平A:Phylum level of bacteria; B:Genus level of bacteria

在菌属水平上选取两类样品最大相对丰度排名前30位的物种制作相对丰度分布柱形图(图2B)，结果发现：皮肤样品的优势菌属依序为葡萄球菌属(19.4%)、嗜冷杆菌属(10.6%)、克雷伯菌属(8.5%)、莫拉菌属(5.1%)、拟杆菌属(3.8%)、梭杆菌属(3.2%)、卟啉单胞菌属(2.6%)、消化链球菌属(2.5%)、伯杰菌属(2.3%)、乳杆菌属(2.3%)、f_Enterobacteriaceae_Unclassified(2.2%)、Frederiksenia(2.1%)、巴氏杆菌属(1.9%)、Corticibacter(1.8%)、放线杆菌属(1.6%)、奈瑟菌属(1.4%)、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group(1.3%)、嗜二氧化碳嗜纤维菌属(1.3%)、f_Cardiobacteriaceae_Unclassified(1.2%)、f_Lachnospiraceae_Unclassified(1.1%)和大肠埃希菌(1.0%)，其余为次要菌属；咬伤样品的优势菌属依序为巴氏杆菌属(17.8%)、拟杆菌属(12.5%)、克雷伯菌属(9.7%)、巨球菌属(6.5%)、葡萄球菌属(6.4%)、奈瑟菌属(5.7%)、Frederiksenia(5.0%)、莫拉菌属(4.0%)、链球菌属(2.6%)、大肠埃希菌(2.4%)、谷氨酸杆菌属(2.1%)、消化链球菌属(2.1%)、伯杰菌属(1.9%)、梭杆菌属(1.8%)、亮杆菌属(1.8%)、f_Cardiobacteriaceae_Unclassified(1.5%)、劳特罗普氏菌属(1.5%)、劳特菌属(1.4%)、藤黄单胞菌属(1.1%)和不动杆菌属(1.0%)，其余为次要菌属。其中，葡萄球菌属和巴氏杆菌属分别是皮肤样品和咬伤样品中相对丰度最高的菌属。

2.3 α多样性分析 对样品的细菌16S rDNA测序OUT数目进行α多样性分析可以反映其菌群的物种丰度和均匀度。α多样性指数包括Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数等。Chao1指数值和ACE指数值越大，表明菌群的物种丰度越高；Shannon指数值越大，表明菌群的多样性越高；Simpson指数值越大，说明菌群的多样性越低。利用Qiime(1.9.1)软件对10只犬的两类样品的OUT数目进行α多样性分析。结果如表1所示，10只咬伤犬20个样品的覆盖率(Coverage指数)均>98%，提示测序结果能真实反映样品的实际情况。20个样品中，ACE指数和Chao1指数降序排名前7位的样品均来自皮肤，皮肤样品的平均Shannon指数和Simpson指数分别高于和低于咬伤样品，表明皮肤样品的物种丰富度和多样性较咬伤样品更高。

表1 皮肤和咬伤样品细菌16S rDNA测序OUT数目的α多样性分析结果Table 1 The α diversity analysis of bacterial 16S rDNA sequencing OUT numbers in skin and bite samples

2.4 β多样性分析 主坐标分析(PCoA分析)是β多样性分析的一种。通过分析不同样品的菌群分布，利用R语言基于Brary-Curtis距离矩阵进行PCoA作图分析。图中20个点代表20个样品，点与点之间的距离越近代表其菌群相似性越高。结果如图3所示，皮肤样品和咬伤样品并没有呈现出明显的聚集，而同一只犬的2个样品聚集在一起。说明同一只犬的2个样品菌群组成较相似，可能存在相关的联系。不同患犬之间的个体差异较大，组间差异并不显著。

图3 各个样品菌群组成的PCoA分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacterial composition in each sample

2.5 群落结构差异显著性分析

2.5.1 Anosim分析 Anosim分析是一种基于样品间距离矩阵的非参数检验，R值和P值用来表示组内和组间是否存在差异及差异是否显著。R值值域为[-1～1]，接近-1表示组内差异大于组间差异；接近0表示组间和组内没有差异，接近于1表示组间差异大于组内差异。本试验中皮肤样品和咬伤样品之间比较R值为-0.043，介于0～-1，P为0.75(P>0.05)，可知皮肤样品和咬伤样品的组内差异大于组间差异，但差异不显著，即样品菌群组成受犬只个体差异影响较大。

2.5.2 Metastats差异分析 Metastats差异分析是基于样品的不同物种丰度数据，利用Metastats软件检测丰度差异，从而得出差异物种。结果显示皮肤样品和咬伤样品中的差异最大的5个菌种分别为Candidatus_Saccharimonas、Conchiformibiu、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Lachnospiraceae_NK4A136_group和乳杆菌属，毛螺菌科NK4A136属和乳杆菌属在2种样品间的差异显著(P<0.05)。其中Lachnospiraceae_NK4A136_group仅存在于皮肤样品中，且所有差异物种在皮肤样品中的丰度均大于咬伤样品。

3 讨论

本试验发现，被咬犬伤口的优势菌主要由巴氏杆菌、拟杆菌、克雷伯菌、巨球菌和葡萄球菌等20种菌组成，与犬的其他伤口相比[6]，厌氧菌的大量存在是咬伤伤口的特征。丰度较大的前几种优势菌种类与前人调查结果一致，但优势菌种类数目和某些优势菌的丰度要远大于前人报道[7-10]，是因为16S rDNA高通量测序技术相比于传统的细菌分离方法得到的菌群信息更加全面、准确[5]。

多种分析结果显示，被咬犬伤口与伤口周边皮肤的菌群在丰度和多样性上虽有差异，但差异并不显著，且二者均存在葡萄球菌、克雷伯菌、奈瑟菌、莫拉菌、大肠埃希菌等共同优势菌，故有理由推测咬伤伤口的菌群主要受皮肤菌群的影响，亦有文献证明犬皮肤破损处菌群可能来自自身菌群[11-12]。

与伤口周边皮肤的菌群相比，被咬犬伤口还存在大量的犬口腔细菌[7,13]，比如巴氏杆菌、拟杆菌等。在撕咬或舔舐伤口过程中，口腔菌常侵染伤口，故推测犬口腔菌群是影响被咬犬伤口菌群的另一因素。

综上，本试验发现犬咬伤伤口菌群以巴氏杆菌和厌氧菌如拟杆菌等为主，主要受犬伤口周边皮肤菌群和口腔菌群的影响。