五味子煎剂对貉源大肠杆菌体外增殖和耐药性的影响

王婧文 ， 谭贻鸿 ， 高昊天 ， 张东林 ， 史秋梅 ， 高桂生 ， 高光平

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066004 ； 2. 北京中医药大学东方学院 ， 河北 廊坊 065001)

五味子是传统中药，属于木兰科植物，在我国有丰富的资源，盛产于中国北方地区特别是东北三省[1]。按照产地不同分为南五味子和北五味子，二者相比，北五味子品质更好，且保存时间长不易霉变[2]。五味子滋补能力强，具有护肝、降糖、降血脂和补肾的功效。研究发现，含有五味子乙素为代表的木脂素类物质，具有抑制细菌增殖、抗氧化、抗病毒等作用 ； 从五味子仁中提取的五仁醇对中枢神经系统有一定的抑制作用，在临床可用于慢性镇痛[3]。中兽医对五味子的使用由来已久，近年来对其有效成分及作用机理的研究不断深入。研究证实，五味子中含有的有机酸和挥发油成分具有镇咳作用，含有的木脂素类成分不仅可以发挥抑菌作用，还能保护机体心肌结构、镇痛和保肝，此外，含有的多糖类物质可增强机体免疫力、抗肿瘤和抗氧化[4]。因此，五味子用于动物养殖过程中可发挥提高免疫力等多种作用。

貉大肠杆菌病是养殖过程中的常见病，主要是由大肠杆菌引起的，大肠杆菌是条件致病菌，常存在于貉肠道内，一旦饲养环境改变，貉抵抗力下降，就会使大肠杆菌大量繁殖，转移至其他器官，引起貉消化系统和呼吸系统疾病，严重时会导致貉死亡[5]。幼貉患大肠杆菌病主要症状是水样腹泻，成年貉还可能出现流产和死胎的现象，严重时还会出现败血症症状[6]，导致毛皮质量下降，给养殖户造成严重的经济损失。通常养殖户使用抗菌药来治疗貉大肠杆菌病，但由于抗菌药的滥用，大肠杆菌的耐药性提高，普通抗菌药难以发挥作用，给治疗带来困难。五味子作为抑菌效果强的中药，逐渐替代抗菌药，但其煎剂浓度对貉源大肠杆菌的增殖能力以及对耐药性的消除效果并不明确。本试验将设立五味子煎剂浓度梯度，通过比较不同浓度下貉源大肠杆菌增殖和耐药基因缺失的程度，探究浓度对细菌增殖和耐药性的影响，以期为五味子的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试菌株为河北省预防兽医学重点实验室分离、鉴定并保存的貉耐药性菌株，菌株编号为L40。五味子，购自秦皇岛民乐药店有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 DL2 000 Marker和2×TaqPCR Master Mix，均购自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS，分析纯)，购自天津市致远化学试剂有限公司。DXY-33A型电泳仪，由北京六一生物科技有限公司生产；AglentsureCycler880 PCR仪，由美国安捷伦公司生产；ChemiDocTMXRS+ 凝胶成像系统，由美国伯乐公司生产；其他试剂和仪器由本实验室提供。

1.3 中药液的制备 称取已粉碎的五味子40 g，过筛后置于烧杯中，加入蒸馏水200 mL，然后静置1 h，加热煮沸，不断搅拌，沸腾后改用文火煮30 min，煎煮完成后用4层纱布过滤；取药渣加入100 mL蒸馏水，重复上述操作；将2次得到的药液合并，去除药渣后用文火浓缩至40 mL，五味子煎剂浓度为1 g/mL；室温静置24 h后离心，将得到的上清液pH调整为7.3左右，然后高压灭菌，放入4 ℃冰箱保存备用[7]。

1.4 菌悬液的制备 将貉源大肠杆菌从冰箱中取出，在营养琼脂培养基平板上复苏、活化；将活化后的貉源大肠杆菌在伊红美蓝琼脂培养基划线培养18 h后，挑取单个菌落，接种于营养肉汤培养基中，置于37 ℃、180 r/min摇床上培养至对数期；用平板计数法进行菌液计数，用无菌PBS将菌液稀释至终浓度为1×107CFU/mL。菌液置于4 ℃保存备用[8]。

1.5 不同浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌增殖的影响 五味子煎剂浓度为1 000.00 mg/mL，用LB培养液进行2倍倍比稀释，获得的10个梯度浓度分别是500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL和0.98 mg/mL。分别吸取上述各浓度的五味子煎剂4 mL，加入1.4中配制好的菌悬液200 μL，37 ℃下静置培养，接种完成记为0 h，每隔4 h吸取菌液进行平板计数[9]。同时，在4 mL LB培养液加入200 μL菌悬液，作为阴性对照；设置SDS浓度分别为0.120%、0.060%、0.030%、0.015%、0.008%，0.150%、0.075%、0.038%、0.019%和0.009%，在4 mL不同浓度的SDS溶液中加入200 μL菌悬液，作为阳性对照。

1.6 不同浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌耐药性的影响 将经1.5处理的貉源大肠杆菌在37 ℃下培养24 h后，接种于LB培养液中，增菌后检测耐药基因。

1.6.1 耐药基因引物 检测β-内酰胺酶类耐药基因blaTEM1、blaPSE1、blaOXA1、blaTEM、blaSHV-1和blaCTX-M，氨基糖苷类耐药基因aadA1和strA-strB，四环素类耐药基因tetA、tetB、tetC和tetD，大环内酯类耐药基因ermB、ermC和ermF，以及磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3，根据参考文献[10]设计耐药基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6.2 耐药基因PCR检测 采用热裂解法制备貉源大肠杆菌DNA，首先将待测菌株划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板上，于37 ℃恒温过夜培养；挑取单菌落加入200 μL灭菌超纯水中，充分混匀，制成菌悬液，100 ℃煮沸10 min，13 000 r/min离心5 min，吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，备用。

将制备的貉源大肠杆菌DNA置于室温融化，以其作为PCR模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，超纯水补至20 μL。四环素类耐药基因PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。氨基糖苷类耐药基因PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；92 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33个循环；最后72 ℃延伸5 min。磺胺类耐药基因PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；92 ℃变性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.7 五味子煎剂作用前后貉源大肠杆菌对抗菌药敏感性的变化 在普通琼脂培养基上分别滴加未经处理的悬菌液和经1.5处理后的菌悬液10 μL，用三角形玻璃棒涂匀，采用K-B法进行药敏试验，37 ℃培养16～18 h，测量抑菌圈的直径，抑菌圈直径在13 mm以下表明貉源大肠杆菌对该药物有耐药性；抑菌圈直径在13～18 mm为中度敏感；抑菌圈直径大于18 mm为高度敏感。

2 结果

2.1 不同浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌增殖的影响 由表1可知，与阴性对照相比，15.63 mg/mL及以上浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌的增殖有明显的抑制作用，且随着五味子煎剂浓度增加，菌株增殖数量逐渐减少；经62.50～500.00 mg/mL五味子煎剂作用12 h后无貉源大肠杆菌增殖。结果表明，15.63 mg/mL及以上浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌增殖存在抑制作用，且随着浓度的增加，抑制作用增强。

表1 不同浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌分离株体外增殖的影响Table 1 Proliferation of E.coli strain in vitro after treatment with different concentrations of Schisandra decoction (CFU/mL)

2.2 不同浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌携带耐药基因的影响 貉源大肠杆菌在五味子煎剂作用前共检出12种耐药基因。由于经62.50～500.00 mg/mL的五味子煎剂作用后貉源大肠杆菌已死亡，因此未检测耐药基因，经0.98～31.25 mg/mL五味子煎剂作用后菌株的耐药基因检测结果见表2，31.25 mg/mL五味子煎剂作用后菌株的耐药基因检测结果见图1。由表2可知，与阴性对照相比，五味子煎剂作用后菌株携带的耐药基因数量明显减少，0.98～3.91 mg/mL五味子煎剂对消除菌株耐药基因的作用较弱，均消除了6种耐药基因；结合图1可知，31.25 mg/mL五味子煎剂消除貉源大肠杆菌的耐药基因数量较多，消除了9种耐药基因。结果表明，五味子煎剂消除貉源大肠杆菌耐药基因的效果随浓度升高而增强。

表2 貉源大肠杆菌分离株经不同浓度的五味子煎剂作用后耐药基因检测结果Table 2 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different concentrations of Schisandra decoction

图1 貉源大肠杆菌分离株经不同药物作用后耐药基因检测结果Fig.1 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different drugsA：阴性对照; B：五味子煎剂浓度为31.25 mg/mL； C：SDS浓度为0.120%A:Negative control; B:Schisandra decoction concentration was 31.25 mg/mL; C:SDS concentration was 0.120%M:DL2 000 DNA Marker; 1:tetA; 2:tetB; 3:tetC; 4:tetD; 5:ermB; 6:ermC; 7:ermF; 8:blaTEM; 9:blaTEM1; 10:blaCTX-M; 11:blaPSE1; 12:blaOXA1; 13:blaSHV-1; 14:aadA1; 15:strA-strB; 16:sul1; 17:sul2; 18:sul3

2.3 五味子煎剂作用前后貉源大肠杆菌对抗菌药敏感性的变化 貉源大肠杆菌经五味子煎剂作用前后对12种常用抗菌药的药物敏感结果见表3。五味子煎剂作用前菌株对6种抗菌药耐药，经五味子煎剂作用后菌株对3种抗菌药耐药。结果表明，经五味子煎剂作用后，貉源大肠杆菌对抗菌药的敏感性增加。

表3 貉源大肠杆菌经五味子煎剂作用前后药物敏感性的变化Table 3 Changes of drug resistance of multidrug resistant E.coli before and after treatment with Schisandra decoction

3 讨论

本试验结果可以证实，五味子煎剂对貉源大肠杆菌有明显的抑菌作用，且随着浓度增加，其抑制貉源大肠杆菌的增殖和消除耐药基因效果增强，并能够提高貉源大肠杆菌对抗菌药的敏感性。本试验可以看出，五味子煎剂可以降低貉源大肠杆菌的菌落数量，与李蕴玉等[11]结果一致。但五味子抑制细菌增殖的作用机理并不明确，有待进一步研究，目前普遍认为五味子中含有的多烯类化合物可以改变细菌细胞膜的通透性，使营养物质流出，阻碍细菌的正常代谢，从而降低细菌增殖速度[3]。本试验结果显示，31.25 mg/mL的五味子煎剂消除貉源大肠杆菌携带的耐药基因较多，而且可提高貉源大肠杆菌对抗菌药的敏感性，但与其他的研究人员报道五味子降低耐药性效果差异较大，据李栋[12]研究证实，五味子可消除禽源大肠杆菌的耐药基因，消除率可达96%，造成不同结果的原因可能为以下三方面：一是不同地区购买的中药品质不同；二是研究的大肠杆菌动物来源不同；三是对中药有效成分提取方法和具体操作步骤不尽相同，从而导致中药液中有效成分有一定的差异，作用效果就会存在差异。目前对五味子的耐药基因消除作用的研究较少，张媛媛[3]研究认为，五味子能降低细菌的耐药性是通过消除细菌的耐药质粒实现的，五味子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的耐药菌株均有明显的抑制作用，其可不同程度地消除多重耐药菌株的体外R质粒。

本试验结果证明，五味子煎剂可以用来治疗貉大肠杆菌病。貉大肠杆菌病是阻碍貉养殖业良性发展的人兽共患病，近几年，由于抗菌药的滥用，大肠杆菌的耐药性逐年提高，给貉大肠杆菌病的预防和治疗带来了极大的困难。有研究发现，20世纪50年代时大肠杆菌对15种抗菌药都高度敏感，但20世纪80年代末90年代初时大肠杆菌对11种抗菌药已产生了耐药性[13]。养殖户对抗菌药的不合理应用也加速了大肠杆菌耐药性的发展，出现了愈来愈多的多重耐药性大肠杆菌，多重耐药性菌株已成为养殖过程中的巨大难题，使得药效下降，用药剂量不断攀升，不仅增加了养殖成本，而且不能有效控制病情发展以及预防疾病的发生，阻碍了毛皮动物养殖业的进步。五味子煎剂在临床上应用不仅可以治疗貉大肠杆菌病，还可消除貉源大肠杆菌的耐药基因，为解决貉源大肠杆菌耐药性增加的问题提供了新思路。

目前为止，有关中药作为耐药性消除剂的作用机理研究较少，且均不够深入，本试验虽然证实了15.63 mg/mL及以上浓度的五味子煎剂对貉源大肠杆菌体外增殖和耐药性有明显的作用效果，但是其作用机理有待进一步研究。本试验证实了五味子煎剂的抑菌作用与其浓度成正比，因此在临床实践中可根据貉的体重适当调高五味子煎剂的浓度用于治疗貉大肠杆菌病。