南疆与北疆代表性规模化猪场沙门菌耐药性的比较分析

轩慧勇 ， 陈月月 ， 易海波 ， 徐琦琦 ， 秦 蕾 ， 吴慧敏 ， 夏利宁

(1. 新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052 ； 2. 新疆霍城县职业技术学校 ， 新疆 霍城 835200 ；3. 新疆昭苏县喀夏加尔镇畜牧兽医站 ， 新疆 昭苏 835618)

沙门菌(Salmonella)是肠杆菌科沙门菌属的兼性厌氧革兰阴性菌，是一种可以在人畜之间直接或间接传播的重要人兽共患病原菌[1]，其宿主广泛，而猪和鸡是沙门菌的主要储存宿主[2]。目前，抗菌药物是治疗细菌性疾病的重要手段之一，但随着抗菌药物的不合理使用，导致耐药沙门菌甚至是多重耐药沙门菌的出现[3]。耐药沙门菌可作为携带耐药质粒、整合子和转座子等可转移元件的供体菌，将耐药基因转移到其他细菌宿主的基因组或质粒中，促进更具毒性和耐药性的分离株出现[4-5]，导致更难以治疗的感染发生，阻碍养殖业发展的同时也对公共卫生健康造成严重威胁。新疆地域辽阔，有南疆和北疆之分，随着养猪业的发展，细菌耐药问题也凸显出来，但有关新疆不同地域沙门菌耐药现状的研究报道较少，因此有必要针对不同地区开展沙门菌耐药性调查，以给予猪场用药指导。本试验选取新疆南北疆代表性地区焉耆县和石河子市猪场分离的猪源沙门菌，比较其对12种抗菌药物的耐药表型，分析其耐药基因型的差异，结合药敏试验结果可指导临床合理使用抗菌药物以治疗猪源沙门菌病。本试验对两地区不同猪场猪源沙门菌进行耐药性调研和耐药基因检测，以期为沙门菌的防控工作提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2019年5月在新疆北疆地区石河子市1个规模化猪场采集猪肛拭子样品200份，经用药情况调研，该猪场曾使用土霉素、氟苯尼考、新诺明、多西环素、青霉素和恩诺沙星等药物。2019年10月在新疆南疆地区焉耆县1个规模化猪场采集猪肛拭子样品300份，经用药情况调研，该猪场曾使用氟苯尼考、头孢噻呋、庆大霉素、二甲氧苄胺嘧啶(敌菌净)和庆大霉素等药物。

1.2 培养基与试剂 SS琼脂培养基和沙门显色培养基，均购自奥博星生物技术有限公司(北京)；甘油和50×TE缓冲液，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、琼脂糖和核酸染料，均购自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙门菌的分离鉴定 根据轩慧勇等[6]使用的方法对样品进行菌株分离，挑取分离的单菌落于沙门显色培养基上进行纯化。纯化后的菌株进行沙门菌特异性侵袭基因invA的鉴定[7]，PCR扩增产物经加核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果经比对，同源性>96%的判定为沙门菌。在装有400 μL新鲜菌液的2 mL无菌EP管中，加入200 μL 60%甘油，一式两份，-80 ℃保存备用。

1.4 最小抑菌浓度值测定 本试验采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[8]发布的M100-S23，运用琼脂稀释法检测沙门菌对12种抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)值，以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，测试菌株药敏试验结果以敏感(S)、中介(I)、耐药(R)3种形式记录。

抗菌药物包括环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)、氨苄西林(Ampicillin，AMP)、头孢噻呋(Ceftiofur，CEF)、头孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、亚胺培南(Imipenem，IPM)、四环素(Tetracycline，TET)、氟苯尼考(Florfenicol，FFC)、多黏菌素(Polymyxin，CL)、磺胺异噁唑(Sulfaisoxazole，SMZ)和磷霉素(Fosfomycin，FOS)，上述药物均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.5 耐药基因检测 通过煮沸法进行DNA模板的制备[9]，制备好的DNA模板于-20 ℃保存备用。对分离鉴定菌株进行blaTEM、blaCMY-2、oqxB、qnrS、oqxA、tetA、tetB、sul1、aadA2、ant(3″)-Ia、floR和aac(6′)-Ib共12种耐药基因的检测，根据参考文献[10-14]合成所需要的引物。反应体系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加灭菌超纯水8.5 μL。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对获取的序列上传至NCBI进行比对，以同源性大于96.0%的结果判定为基因比对结果。

1.6 统计分析 不同地区猪场的耐药差异性采用SPSS 20软件进行卡方检验分析，以P<0.05表示有显著性差异，以P>0.05表示无显著性差异。

2 结果

2.1 不同猪场猪源沙门菌的分离鉴定 经SS培养基、沙门菌显色培养基和invA基因鉴定，北疆地区石河子市沙门菌的分离率为40.5%(81/200)，南疆地区焉耆县沙门菌的分离率为9.0%(27/300)。

2.2 不同猪场猪源沙门菌的药敏试验 不同猪场猪源沙门菌对被检药物的耐药率结果如表1所示，焉耆县猪场分离的猪源沙门菌对磺胺异噁唑的耐药率高达100.0%，对氟苯尼考(55.6%)和四环素(40.7%)的耐药率也超过40.0%；石河子市猪场分离的猪源沙门菌对磺胺异噁唑耐药率高达100.0%，对环丙沙星、氨苄西林、氟苯尼考和四环素的耐药率超过70.0%。不同地区猪场分离的猪源沙门菌均对阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南、多黏菌素和磷霉素高度敏感，无耐药菌株检出。经卡方检验分析，石河子市猪场猪源沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋和四环素的耐药率显著高于焉耆县猪场猪源沙门菌(P<0.05)；焉耆县猪场猪源沙门菌对庆大霉素的耐药率显著高于石河子市猪场猪源沙门菌(P<0.05)；不同地区猪场猪源沙门菌对氟苯尼考和磺胺异噁唑耐药率无显著性差异(P>0.05)。

表1 不同猪场猪源沙门菌的耐药率比较Table 1 Comparison of drug resistance rates of Salmonella strains from different pig farms

2.3 不同猪场猪源沙门菌多药耐药性 不同猪场猪源沙门菌对被检抗菌药物的多药耐药性结果如图1所示，不同猪场猪源沙门菌对被检12种抗菌药物的多药耐药在1～6耐分布，焉耆县猪场猪源沙门菌多药耐药以5耐为主(14.8%，4/27)，单药耐药占48.2%(13/27)；石河子市猪场猪源沙门菌多药耐药主要集中在5耐(59.2%)和6耐(17.3%)，占76.5%。

图1 不同地区猪场猪源沙门菌多重耐药性Fig.1 Multidrug resistance of Salmonella strains from different pig farms不同地区比较，*：P<0.05;下图同Comparison of different regions,*：P<0.05. The same as below

2.4 不同猪场猪源沙门菌的耐药基因检测 不同猪场猪源沙门菌耐药基因检测结果如图2所示，焉耆县猪场猪源沙门菌中检出所有被检耐药基因，其中floR耐药基因检出率最高，达40.7%，ant(3″)-Ia和sul1基因检出率次之，均为33.3%，其余耐药基因的检出率介于3.7%～22.2%；石河子市猪场猪源沙门菌的耐药基因检测结果显示：除blaCMY-2和tetA基因未检出外，其他被检耐药基因的检出率均高于焉耆县，对blaTEM(74.1%)、tetB(76.5%)、oqxA(77.8%)、aadA2(77.8%)、ant(3″)-Ia(77.8%)和sul1(77.8%)基因的检出率均在70.0%以上，对floR、qnrS、oqxB和aac(6′)-Ib基因的检出率依次为66.7%、64.2%、53.1%和49.4%。

图2 不同地区猪场猪源沙门菌耐药基因检测Fig.2 Detection of drug resistance genes in Salmonella strains from different pig farms

3 讨论

3.1 沙门菌的耐药性 沙门菌作为人兽共患病病原菌可引起人和动物的多种疾病，随着耐药沙门菌的出现，对人类健康造成威胁，且延长动物疾病治疗时间，增加治疗成本。新疆地广人稀，南北疆路途遥远，不同地域之间动物源沙门菌耐药性是否存在差异值得研究。本试验中新疆南北疆地区不同猪场猪源沙门菌对磺胺异噁唑的耐药率均高达100.0%，耐药率结果高于段瑶等[15](73.32%)和彭斌等[16](61.5%)报道的沙门菌对磺胺异噁唑的耐药率；本试验中，不同猪场猪源沙门菌对氟苯尼考的耐药率均超过50.0%，说明有必要对耐药菌株进行深入研究与紧急预防。

值得注意的是，新疆南北疆地区不同猪场猪源沙门菌整体耐药结果趋势相同，都有环丙沙星、氨苄西林、四环素、氟苯尼考和磺胺异噁唑耐药菌株检出。但北疆地区石河子市猪源沙门菌耐药情况更严峻，对氨苄西林和环丙沙星的耐药率均高达80.0%以上，对四环素和氟苯尼考的耐药率也超过70.0%，该结果低于加春生[14]的研究结果(对氨苄西林耐药率达到100.0%，对四环素耐药率达到88.0%)。此外，北疆地区石河子市猪场猪源沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、头孢噻呋和四环素这4种抗菌药物的耐药率均显著高于南疆地区焉耆县猪场猪源沙门菌，造成这种现象的原因可能是：石河子市作为新疆重要的畜牧养殖地，养猪业的发展趋于集约化大规模养殖，长期处于低剂量的抗菌药物选择压力下，更易于耐药菌的产生。而焉耆县作为回族自治县，养猪业的发展较滞后，抗菌药物的使用频率和剂量较少，因此耐药率低于石河子市猪源沙门菌。焉耆县和石河子市猪场猪源沙门菌均对庆大霉素具有较好的敏感性，焉耆县猪场猪源沙门菌对庆大霉素的耐药率为11.1%，石河子市猪场猪源沙门菌对庆大霉素完全敏感。不同地区猪场猪源沙门菌均无阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南、多黏菌素和磷霉素耐药菌株检出，与曹阳等[17]报道的耐药结果一致。

本试验多药耐药结果显示，石河子市猪场猪源沙门菌的多药耐药以5耐为主，焉耆县猪场猪源沙门菌多药耐药虽然也以5耐为主，但其数量远低于石河子市猪场猪源沙门菌的多药耐药，其单药耐药沙门菌数量占主导。因此不同地区猪场可结合药敏试验结果，合理选用抗菌药物提高疗效，以降低耐药菌的出现。

3.2 沙门菌的耐药基因 耐药基因的携带不仅使细菌对抗菌药物的耐药性升高，并且会造成环境污染，导致更严重的耐药性产生。本试验耐药基因检测结果显示，焉耆县和石河子市不同猪场猪源沙门菌中耐药基因携带率不同，石河子市猪场猪源沙门菌耐药基因携带率高，10种耐药基因检出率都超过49.0%；而焉耆县猪场猪源沙门菌耐药基因携带种类更多，12种耐药基因都有检出，但耐药基因检出率均低于41.0%。结合耐药结果可以看出，耐药基因携带率与耐药率呈正相关。有趣的是，焉耆县猪场猪源沙门菌耐药率和多药耐药率都低于石河子市，尽管基因的检出种类高于石河子市，但检出基因的携带率都远低于石河子市。比较发现，焉耆县猪场猪源沙门菌对四环素的耐药性是由tetA(22.2%)和tetB(29.7%)这2种基因共同作用的结果，而石河子市猪场猪源沙门菌对四环素的耐药性主要是由tetB(76.5%)基因介导。焉耆县猪场猪源沙门菌对氨苄西林的耐药性主要由blaTEM和blaCMY-2基因共同介导，但石河子市猪场猪源沙门菌对氨苄西林的耐药性主要由blaTEM基因介导。以上结果说明，虽然对同一种抗菌药物耐药，但不同地区猪场主要流行的耐药基因型不同。不同地区猪场猪源沙门菌对酰胺醇类耐药基因floR的检出率均在40.0%以上，远低于王刚等[18]报道的西藏地区猪源沙门菌floR耐药基因的检出率(96.96%)，氟苯尼考作为农业农村部批准使用的动物专用抗菌药，临床中的长期使用不仅导致沙门菌对其耐药率提高，相关耐药基因的携带率也升高。在养殖过程中，需要实时跟踪细菌耐药情况的变化，制备更科学的治疗方案。

此外，肠道作为耐药基因的储存库，肠道菌群在获得耐药性后，往往可以通过多种方式将耐药性传播，如喹诺酮类耐药基因可通过质粒进行传递，导致细菌产生多重耐药现象[19]，还可通过转座子和整合子在不同细菌之间进行转移，而新型耐药基因的发现[如已报道的tet(X5)、tet(X6)等]证实细菌产生耐药性的速度极快[20]。因此研究沙门菌耐药性的产生和传播，对于耐药菌株的追踪溯源和预防控制具有重要意义。

综上所述，新疆石河子市猪场猪源沙门菌对环丙沙星、氨苄西林和四环素的耐药率高于焉耆县猪场猪源沙门菌，在进行沙门菌病治疗时，可选用敏感性高的抗菌药物，如庆大霉素、头孢曲松等。石河子市猪场猪源沙门菌耐药基因携带率高，但焉耆县猪场猪源沙门菌耐药基因携带种类更多，且耐药率与耐药基因呈正相关。本试验结果可为不同地区猪场猪源沙门菌病的治疗和合理用药提供科学依据。