补肾活血方对复发性流产孕鼠Th17/Treg平衡及妊娠结局的影响

陈颖庆，邓阿黎,，陈林娜，周忠明，王燕萍，金 晶，向 英，吴 双，徐 静，余 念，卢雯婷，李 婷，詹 妮

(1. 湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2. 湖北中医药大学附属湖北省中医院，湖北 武汉 430060)

复发性流产(RSA)是指与同一配偶连续发生2次或2次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失[1]。病因学研究显示子宫结构、染色体、内分泌、免疫、血栓前状态、感染等因素均与RSA发生有关，但仍有50%病因不明确。胎儿作为半同种异体移植体，能够在母体内成功妊娠至分娩，关键在于母体与胎儿之间的相互免疫耐受。目前，关于RSA的研究方向主要聚焦于免疫和炎症介质等方面，当母胎界面的免疫平衡打破后，母体可能对胚胎产生排斥反应导致流产。Sereshki等[2]研究报道，在月经周期增殖期和分泌期，RSA患者的辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)比值显著高于正常妊娠孕妇。钱金凤等[3]发现不明原因复发性流产(URSA)患者蜕膜组织中Th17/Treg比值明显高于正常妊娠早期选择流产的妇女，表明Th17/Treg细胞免疫之间的平衡可能与妊娠结局密切相关。中医学认为RSA不仅耗损肾气，且易恶血留内。根据古今医家治疗RSA的临证经验，总结病机多以肾虚为本，血瘀为标，临床上以寿胎丸加减化裁而成补肾活血方治疗屡见效验[4-5]。本课题组前期临床研究发现，补肾活血方可有效改善RSA患者免疫微环境[6]。本实验通过建立RSA孕鼠模型，观察补肾活血方干预后Th17/Treg平衡及相关细胞因子水平的变化和妊娠结局，进一步探究了补肾活血方的免疫效应机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级CBA/J雌鼠60只，BALB/C雄鼠5只，DBA/2雄鼠25只，周龄7～8周，体重(19±2)g，22 ℃环境下适应性喂养1周。CBA/J雌鼠、BALB/C雄鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司,实验动物许可证号：SCXK(京)2020-0004；DBA/2雄鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。本研究已通过湖北中医药大学附属医院湖北省中医院动物伦理委员会审查[鄂中医院动(福)第2020006号]。

1.2药物 补肾活血方组成：菟丝子20 g、桑寄生15 g、续断15 g、阿胶10 g、丹参10 g、川芎6 g，中药均购于湖北省中医院。制备：中药(阿胶除外)用8倍水浸泡30 min，大火先煮沸30 min，倒出药液，再加入4倍水，煮沸30 min；合并药液并加入已经烊化的阿胶，水浴浓缩，最后配制成补肾活血方(含生药3.8 g/mL)，置于-20 ℃冰箱备用。地屈孕酮溶液：将地屈孕酮片(荷兰 Abbott Healthcare Products B.V.公司，批准文号H20170221，规格：10 mg/片)3片溶于200 mL蒸馏水，稀释至1.5×10-4mg/mL，放置于-20 ℃冰箱备用。

1.3主要试剂及仪器 白细胞介素-17(IL-17)(货号：MU30074)和转化生长因子-β(TGF-β)(货号：MU30574)酶联免疫吸附法检测试剂盒，Bioswamp；DMEM培养基(货号：SH30022.01B)，Hyclone公司；磷酸盐缓冲盐溶液(货号：P1010)、0.25%胰蛋白酶(货号：T1350)、 胎牛血清(货号：P1400)、钙离子霉素(货号：18800)、莫能菌素钠(货号：M8670)，solarbio；Ⅱ型胶原酶(货号：17101015)，Gibco 公司；流式抗体FITC-CD4(货号：11-0041-82)、PE-IL-17A(货号：12-7177-81)、 PE-Cy5-CD25(货号：15-0251-82)、PE-FoxP3(货号：12-5773-82)，eBioscience；固定破核剂(货号：562574)，BD bioscien；佛波酯 PMA(货号：P1585)，Sigma；超净工作台(型号：SW-CJ-2D)，苏州智净净化设备有限公司；CO2恒温培养箱(型号：311)，美国Thermo 公司；移液器(型号：F3)，美国 Thermo 公司；倒置荧光显微镜(型号：DMIL LED)，Leica 公司；流式细胞仪(货号：NovoCyte)，艾森。

1.4实验方法 将CBA/J雌鼠与BALB/C雄鼠2∶1合笼建立正常妊娠模型，将CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠2∶1合笼建立RAS模型。合笼次日7：00和19：00观察阴栓，检出阴栓计为妊娠第1天，妊娠后雌鼠与雄鼠分开隔离饲养。取10只正常妊娠孕鼠作为正常妊娠组，给予生理盐水灌胃；取50只RAS孕鼠按随机区组法分为5组各10只：自妊娠第1天开始，模型组给予生理盐水灌胃，地屈孕酮组给予6.18 mg/kg地屈孕酮溶液灌胃，补肾活血方低、中、高剂量组按1∶2∶4比例分别给予7.83 g/kg、15.67 g/kg、31.34 g/kg补肾活血方灌胃，灌胃剂量根据动物体表面积直接换算法[7]计算，每组灌胃量均稀释至0.4 mL，每天1次，连续灌胃14 d。

1.5观察指标及方法

1.5.1血清IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值 干预结束后4 h，孕鼠眼眶取血，室温静置10 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清，参照试剂盒说明采用酶联免疫吸附法检测血清中IL-17、TGF-β水平，计算IL-17/TGF-β比值。

1.5.2胚胎吸收率 干预结束后4 h，对各组孕鼠称重，然后麻醉断颈处死,无菌状态下迅速解剖，暴露子宫，记录存活胚胎数(存活胚胎呈粉红色，饱满)以及吸收胚胎数(胚胎体积比存活胚胎明显缩小，且色暗，或胚胎完全吸收至孕前状态)，计算胚胎吸收率[丢失胚胎数/(丢失胚胎数+存活胚胎数)×100%]。

1.5.3脾脏细胞中Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值 观察胚胎情况后，无菌状态下快速分离各组孕鼠脾脏，充分剪碎，制成匀浆液，用200目孔径不锈钢网过滤，分离获得脾脏淋巴细胞，调整细胞悬液浓度为1×107/mL。取脾脏淋巴细胞悬液100 μL，加入刺激阻断合剂佛波酯(终浓度50 ng/mL)、离子酶素(终浓度2 μg/mL)、高尔基体阻断剂莫能菌素钠(终浓度3 μg/mL)混合液2 μL， 在37 ℃、5%CO2条件下孵育6 h，PBS漂洗， 1 500 r/min离心，弃上清，加入0.5 μL CD4-FITC，4 ℃避光孵育0.5 h，加入1 mL固定剂，孵育20 min，加入1 mL破膜剂,孵育10 min，再加入0.625 μL 的IL-17抗体，4 ℃避光孵育45 min，PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+IL-17A+细胞占 CD4+T 淋巴细胞的比例即为Th17细胞比例。同上取各组孕鼠脾脏淋巴细胞悬液100 μL，加入0.5 μL CD4-FITC 和 0.625 μL PE-Cy5-CD25抗体，4 ℃避光孵育0.5 h，PBS漂洗，固定、破膜，加入5 μL的 Foxp3-PE抗体，4 ℃避光孵育45 min，PBS 缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测 CD4+CD25+FoxP3+细胞占CD4+T 淋巴细胞的比例即为Treg细胞比例。根据Th17细胞比例和Treg细胞比例计算Th17/Treg比值。

1.6统计学方法 所有数据采用SPSS 25.0软件进行分析。计量数据均行正态性检验，若符合正态分布，则组间两两比较采用独立t检验；若不符合正态性分布，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验。胚胎吸收率采用2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组孕鼠血清IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比较 与正常妊娠组比较，模型组血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明显升高(P均<0.05)，血清TGF-β水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，地屈孕酮组及补肾活血方各组血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明显降低(P均<0.05)，血清TGF-β水平均明显升高(P均<0.05)；地屈孕酮组和补肾活血方中剂量组血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值均明显低于补肾活血方低、高剂量组(P均<0.05)，血清TGF-β水平均明显高于补肾活血方低、高剂量组(P均<0.05)，地屈孕酮组各指标与补肾活血方中剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常妊娠组和复发性流产各组孕鼠外周血IL-17、TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比较

2.2各组孕鼠胚胎吸收率比较 正常妊娠组和模型组孕鼠胚胎吸收率分别为8.57%(6/70)和47.14%(33/70)，模型组明显高于正常妊娠组(P<0.05)。地屈孕酮组及补肾活血方低、中、高剂量组孕鼠胚胎吸收率分别为12.12%(8/66)、30.00%(18/60)、11.76%(8/68)、26.79%(15/56),均明显低于模型组(P均<0.05)；补肾活血方低、高剂量组胚胎吸收率均明显高于地屈孕酮组和补肾活血方中剂量组(P均<0.05)，补肾活血方中剂量组与地屈孕酮组比较差异无统计学意义差异(P>0.05)。

2.3各组孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例、Treg细胞比例及Th17/Treg比值比较 与正常妊娠组比较，模型组脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例、Th17/Treg比值均明显升高(P均<0.05)，Treg细胞比例明显降低(P<0.05)；与模型组比较，地屈孕酮组及补肾活血方各组脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例、Th17/Treg比值均明显降低(P均<0.05)，Treg细胞比例均明显升高(P均<0.05)；地屈孕酮组和补肾活血方中剂量组脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例、Th17/Treg比值均明显低于补肾活血方低、高剂量组(P均<0.05)，Treg细胞比例均明显高于补肾活血方低、高剂量组(P均<0.05)，地屈孕酮组各指标与补肾活血方中剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常妊娠组及复发性流产各组孕鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例、Treg细胞比例及Th17/Treg比值比较

3 讨 论

目前研究证实，有50%～60%的RAS是由免疫因素引起的，其分为自身免疫型和同种免疫型，与母胎免疫耐受机制异常有关，主要包括人类白细胞抗原表达异常，自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞等免疫细胞的功能及凋亡异常，补体系统与趋化因子等表达异常，免疫平衡打破后可引发机体产生炎症反应，进而促进母胎界面微循环血栓形成，导致流产[8]。

T淋巴细胞约占蜕膜免疫细胞的15%， Th1/Th2平衡是母胎界面免疫耐受机制中的关键点，成功妊娠者以Th2型优势免疫为主，但相关研究发现RAS孕妇也存在Th2免疫优势[9]，提示这一体系不足以解释母体与胎儿之间的耐受机制。张建平教授团队发现，与正常妊娠者相比，URSA孕妇外周血中Th17细胞数量增加，Treg细胞数量减少，Th17/Treg在妊娠中的作用逐渐成为研究焦点[10]。Treg细胞和Th17细胞均由CD4+T细胞分化而来。Treg细胞在正常妊娠早期的蜕膜组织中已开始增殖，主要通过抑制CD4+、CD8+T细胞增殖与细胞因子产生，抑制B淋巴细胞产生免疫球蛋白抑制NK细胞的杀伤活性，抑制树突状细胞成熟等途径发挥免疫抑制作用。Th17细胞具有促炎性作用，在妊娠感染时，可诱导保护性免疫，但在Th17免疫优势下可导致母胎界面中性粒细胞过度浸润，两者在功能上相互拮抗，在一定条件下Treg细胞和Th17细胞可相互转化。IL-17主要由Th17细胞分泌，其是一种对妊娠免疫极为重要的炎症介质，可通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6及趋化因子如单核细胞趋化蛋白1等的表达，介导炎症细胞在子宫内膜浸润，引起局部炎症损伤进而导致流产[11]。TGF-β是一类可控制细胞增殖、识别、分化和凋亡等过程的细胞因子，高剂量TGF-β可单独刺激初始CD4+T细胞向Treg细胞分化，抑制Th17细胞的分化，促进母胎免疫耐受；低剂量TGF-β与IL-6激活树突状细胞产生的促炎细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23与前列腺素E2协同刺激初始CD4+T细胞向Th17细胞过度分化，导致妊娠早期螺旋动脉重构不完全和胎盘植入浅[12]。Wang等[13]发现外源性IL-17可导致CBA/J×BALB/C小鼠模型的流产率提高，抑制TGF-β的表达，但在小鼠交配前，通过输注外源性正常孕鼠Treg细胞可以降低流产率和促进TGF-β的表达，提示IL-17、TGF-β及Th17/Treg细胞在RAS的发病机制中可能发挥关键作用。

目前西医治疗RAS的措施包括黄体支持治疗(如黄体酮注射液、地屈孕酮、微粒化黄体酮胶囊)、增强妊娠免疫应答治疗(如白细胞主动免疫、免疫球蛋白被动免疫)、糖皮质激素(如低剂量泼尼松)或免疫抑制剂(如羟氯喹)抑制自身抗体和低分子肝素或阿司匹林抗凝等，治疗机制明确，但存在疗程长、有潜在不良反应(如胎儿畸形、产前或产后出血等)、治疗效果有限等问题[14]。

中医认为RAS属于“数堕胎”“滑胎”“屡孕屡堕”范畴，最早记载于《诸病源候论》。《医宗金鉴·妇科心法要诀》记载“若怀胎三、五、七月，无故而胎自堕，至下次受孕亦复如是，数数堕胎，则谓之滑胎”，描述滑胎在临床为反复发生，往往发生在相近孕期的特点。母体方面病因主要有肾虚、脾虚、气血虚弱、血热、血瘀，胎儿方面病因主要有禀赋不足、孕后所伤。肾为先天之本，元气所在，肾主生殖，为胎孕之根本，若母体肾虚，胎失所系，则屡孕屡堕；肾虚则精血乏源、脉道枯竭而致血瘀，脾虚脾气不足可致血行不畅、脉络瘀阻，气血虚弱则血行不畅、脉道枯竭致瘀，血热互结可使血液黏滞而运行不畅，或热灼脉络、血溢脉外导致血瘀，最终导致冲任损伤、胎元不固，引起滑胎。罗辉等[15]对25篇采用活血化瘀法治疗RAS的文献统计显示，有13篇文献报道患者的中医证型有血瘀证。武颖等[16]对150例RAS患者进行中医辨证研究，其中肾虚证48例占32.0%，血瘀证52例占34.7%。可见滑胎总病机以肾虚为本，血瘀为标，故治宜补肾、活血。卫爱武等[4]研究发现，补肾活血方联合主动免疫疗法能改善URSA 患者的免疫耐受性，调节Th1/Th2平衡，显著提高胎儿的存活率。张扬等[17]研究证实，补肾活血方治疗URSA的机制可能与调节蜕膜细胞中TNFR1、P110、Bcl-xl表达有关。金志春等[18]研究表明补肾活血中药能通过降低生殖免疫抗体滴度或者使其转阴而提高妊娠率及妊娠成功率。本实验所用补肾活血方以寿胎丸合丹参、川芎补肾活血兼顾，寿胎丸中菟丝子、桑寄生、续断、阿胶配伍补肾填精、滋阴养血，共奏补肾安胎之效；相关研究证实，寿胎丸可以增加体内雌孕激素水平，促进人绒毛膜促性腺激素的分泌，调控滋养细胞的增殖，可增强母体保护性免疫功能[19-21]。丹参活血调经、祛瘀止痛，广泛用于血瘀证，为调经要药，中医有“一味丹参散，功同四物之说”；川芎行气活血止痛，善通达气血，为“血中气药”。丹参、川芎可降低血液黏度与血流阻力，调节免疫紊乱，抑制炎症因子产生、抗原抗体反应及抗心磷脂抗体的形成，促进抗原抗体复合物吸收[6，22-23]。相比西医疗法，中医补肾活血方中药具有多靶点、多途径作用优势。

CBA/J和DBA/2小鼠属于近交品系，CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠交配作为研究URAS动物模型已被运用多年[24]。本实验结果显示，地屈孕酮及低、中、高剂量均可明显降低孕鼠血清IL-17水平及IL-17/TGF-β比值、胚胎吸收率、脾脏淋巴细胞中Th17细胞比例和Th17/Treg比值，提高血清TGF-β水平及脾脏淋巴细胞中Treg细胞比例，使Th17/Treg平衡趋向正常妊娠孕鼠；补肾活血方中剂量疗效与地屈孕酮疗效相似，中剂量补肾活血方恰等同于临床成人用药剂量；低剂量可能因为药物浓度不够，高剂量可能因药物浓度过高，方中丹参太过寒凉，且高浓度药物在灌胃过程中阻力较大，可能伤及小鼠消化道而影响胃消化吸收功能，故均未达到理想的治疗效果。

综上所述，妊娠早期补肾活血方可能通过促进免疫抑制因子Treg细胞、TGF-β生成，抑制促炎相关免疫因子IL-17及Th17细胞生成，维持免疫微环境平衡，诱导母胎免疫耐受，进而改善RSA孕鼠妊娠结局。该实验为后续研究补肾活血方具体的作用靶点提供了一定基础，但是RSA涉及的免疫因素复杂，还需更深入地探索其机制，且其应用剂量仍有待进一步明确。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。