黄芪汤对肝硬化大鼠胶原沉积和肝窦毛细血管化标志物表达的影响

陈高峰，麦静愔，陈 澍，柯碧莲，王浩艺，谭英姿，陈天阳，成 扬

(1. 上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；2. 上海市光华中西医结合医院，上海 200052；3. 复旦大学附属华山医院，上海 200040；4. 上海市第一人民医院，上海 200080)

肝硬化患者主要表现为肝细胞功能障碍与门静脉高压症，门静脉高压症最主要后果是食管和胃底静脉曲张破裂导致的上消化道出血[1]。肝硬化门静脉高压症的防治一直是临床难题，现代医学在血流动力学水平上尝试建立了一些治疗方法，如使用β受体阻滞剂和5-单硝酸异山梨醇酯、经颈静脉肝内门腔静脉分流术等，虽然这些方法能在一定程度上缓解门脉高压，但是上述治疗措施对引起门脉高压的根本原因即肝纤维化没有治疗作用，相反因肝脏血流量不增加甚或减少，实际对肝损伤的修复反而有害[2-3]。基于肝硬化“虚损生积”理论的指导[3-4]，课题组发现重用补益虚损方药黄芪汤促进机体精气来复、形质亏损的修复，可明显缩短乙型肝炎后肝硬化伴轻中度食管胃静脉曲张患者的门静脉直径，降低食管静脉曲张Palmer评分[5]。本实验通过复制胆管结扎大鼠肝硬化模型，观察该方对肝组织胶原沉积和肝窦毛细血管化标志物表达的影响，旨在进一步研究该方的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性SPF级Wistar大鼠50只，体重(240±30)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCX(沪)2017-0005。自由进食和饮水，适应环境1周后进行实验。本研究经上海中医药大学伦理委员会批准(PZSHUTCM2019041835)。

1.2药物、试剂和主要仪器 黄芪汤由炙黄芪30 g、炙甘草5 g组成，委托江苏江阴天江药业有限公司制作颗粒剂。苏木素复染液：生工生物工程(上海)股份有限公司；OCT 包埋剂：美国Sacura公司；Trizol提取试剂盒：美国Invitrogen公司；Real-time PCR试剂盒：上海索莱宝公司；戊巴比妥钠：美国Sigma公司；SYBR Green PCR Master Mix：Thermo Fisher Scientific公司；cDNA反转录试剂盒，大连宝生物公司；Ⅰ型胶原(Col-I)抗体、血管内皮标志物分化抗原簇31(CD31)抗体和Ⅱ抗：武汉博士德公司；血清肝功能试剂盒：南京建成生物工程研究所；分析天平：德国Satorius公司；RM2035轮转切片机、EMUC7冰冻切片机、ASP300自动脱水机、EG1160石蜡包埋机：德国Leica公司；Real-time PCR系统：美国Applied Biosystems公司。

1.3实验方法 选取10只雄性Wistar大鼠作为假手术组，选取40只雄性Wistar大鼠进行肝硬化造模。造模方法参考文献[6]：大鼠称重麻醉后固定，皮肤消毒，开腹暴露肝脏，在门静脉附近找到胆总管，使用手术缝线双重结扎，然后切断胆管，关腹消毒切口。假手术组大鼠开腹后仅牵引胆管，不进行离断结扎等处理，其余处理同造模大鼠。造模1周后将大鼠随机分为4组各10只，黄芪汤低、中、高剂量组分别按照人体用量的3.5倍、7倍、14倍给予黄芪汤0.35，0.70，1.40 g/kg灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃4周。

1.4检测指标及方法

1.4.1血清肝功能指标 实验结束，大鼠麻醉后下腔静脉取血，采用赖氏法检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平，采用嗅甲酚绿法检测白蛋白(ALB)水平，采用苯甲酸钠-咖啡因比色法检测总胆红素(TBil)水平。

1.4.2肝组织病理学观察 取血后处死大鼠，摘取肝组织，经10%福尔马林固定后石蜡包埋并切片，65 ℃烤箱烤片，二甲苯及无水乙醇逐级脱蜡后进行HE染色，镜下观察。

1.4.3肝组织中Col-I和CD31表达情况 参考文献[7]，采用免疫组织化学染色法观察：烤切片，65 ℃ 60 min；石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)，微波炉抗原修复；3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加相应一抗，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，4 ℃冰箱孵育过夜，次日37 ℃水浴箱复温45 min；滴加相应二抗，37 ℃孵育20 min；新鲜配制的DAB避光显色3 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。在光学显微镜下观察。

1.4.4肝组织中Col-I、CD31、vWF mRNA表达情况 采用Real-time PCR检测：参考文献[8]，Trizol法提取肝组织总RNA，采用试剂盒进行反转录合成cDNA，合成反应体系：4 μL 5 x RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、1 μL Primer Mix、4 μL抽提的 RNA模板、7 μL DEPC水，混匀后放置于PCR仪之中，反应条件为37 ℃ 30 min和85 ℃ 5 s。Real-time PCR反应体系：总体积为20 μL(1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、10 μL SYBR Green、1 μL DNA溶液和7 μL灭菌水)。引物序列：Col-I上游引物5’-TGTCTGGTTTGGAGAGAGCA -3’,下游引物5’- AGTGATAGGTGATGTTCTGGGA -3’，引物长度140 bp；CD31上游引物5’-ACCAACAGCCATTACGACTC -3’,下游引物5’-GTTCCATCAAGGGAGCCTTC-3’，引物长度105 bp；vWF上游引物5’-GGTTGACTTATGCACGACCT-3’,下游引物5’-CAGCATTCGCTCTGACTCTT-3’， 引物长度135 bp； GAPDH上游引物5’-CCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’,下游引物5’-GTTGATGGCAACAATGTCCAC-3’， 引物长度138 bp。扩增循环反应条件：95 ℃预变性30 min，然后95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共循环40次。以GAPDH为内参照，目的基因的表达使用2-△△Ct法进行计算分析。

2 结 果

2.1各组大鼠肝功能指标比较 实验期间，模型组死亡2只，黄芪汤低剂量组死亡1只，其余各组大鼠无死亡。模型组大鼠血清ALT、AST、TBil水平均显著高于假手术组(P均<0.05)，血清ALB水平显著低于假手术组(P<0.05)；黄芪汤各组大鼠血清ALT、AST、TBil水平均显著低于模型组(P均<0.05)，血清ALB水平均显著高于模型组(P均<0.05)，且黄芪汤高剂量组各指标改善情况均显著优于黄芪汤低、中剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 假手术组及肝硬化各组大鼠血清肝功能指标水平比较

2.2各组大鼠肝组织HE染色表现 假手术组大鼠的肝脏小叶结构正常清晰，肝细胞索围绕中央静脉四周呈放射状排列，所有汇管区、中央静脉和胆管结构正常，未见肝细胞变性坏死；模型组大鼠肝内发现数量较多的小胆管增生，尤其是门脉区观察到大量纤维结缔组织增生，纤维间隔向肝小叶内伸展，在胆管上皮细胞周围发现聚集的成纤维细胞和大量沉积的细胞外基质，假小叶形成；与模型组比较，黄芪汤各组大鼠肝内小胆管、成纤维细胞和胶原纤维明显减少，其中黄芪汤高剂量组病变最轻。见图1。

图1 假手术组及肝硬化各组大鼠肝组织HE染色表现(×200)

2.3各组大鼠肝组织Col-I免疫组化染色情况 假手术组大鼠仅在中央静脉及汇管区周围见极微量Col-I沉积；模型组大鼠肝组织中有大量Col-I沉积，尤其在增生胆管周围、纤维间隔周围更明显；黄芪汤各组大鼠Col-I沉积较模型组明显减少，其中黄芪汤高剂量组沉积最少。见图2。

图2 假手术组及肝硬化各组大鼠肝组织Col-I免疫组化染色表现(×200)

2.4各组大鼠肝组织CD31免疫组化染色情况 假手术组肝组织未见阳性染色；模型组在增生胆管周围、小叶中央静脉周围、汇管区见细胞质黄色或者棕黄色颗粒(CD31阳性表达)；与模型组比较，黄芪汤各组CD31阳性表达有不同程度减少，其中黄芪汤高剂量组表达最少。见图3。

图3 假手术组及肝硬化各组大鼠肝组织CD31免疫组化染色表现(×200)

2.5各组大鼠肝组织中Col-I、CD31和vWF mRNA表达情况 模型组大鼠肝组织中Col-I、CD31和vWF mRNA相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)；黄芪汤各组大鼠肝组织中Col-I、CD31和vWF mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且黄芪汤高剂量组均明显低于黄芪汤低、中剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 假手术组及肝硬化各组大鼠肝组织中Col-I、CD31和vWF mRNA相对表达量比较

3 讨 论

上消化道出血是肝硬化门静脉高压症患者的主要死亡原因，患者静脉曲张的前2年出血的风险为25%～35%，首次出血病死率高达30%～50%，大部分患者由于无法控制的出血而死亡[1]。目前的西医用药存在禁忌证和耐药性等问题，只推荐用于预防中重度食管静脉曲张患者的首次出血或再出血；经颈静脉肝内门腔静脉分流术存在一些并发症，仅在反复急性上消化道出血或急性出血内科保守治疗无效时应用[2]。针对临床实践中肝硬化门静脉高压症治疗和预防存在的困境，从传统中医宝库中发掘治疗方法和措施，无疑是一项十分有益的举措。

肝硬化属于中医“积证”的范围，近20年来，中医药抗肝纤维化取得了显著成效[9]。上海中医药大学2010年10月结题的国家重点基础研究973计划“肝硬化虚损生积的中医病因学研究”课题结果显示，黄芪汤治疗48周，纤维化S4期慢性乙型肝炎肝硬化代偿期患者肝纤维化改善率为53.6%，肝组织汇管区炎症和碎屑状坏死改善率分别为71.4%和57.1%，与扶正化瘀方疗效无显著差异；黄芪汤的作用主要表现在抑制肝细胞坏死和改善肝硬化肝功能方面，而扶正化瘀方的作用主要表现在影响纤维组织代谢上。说明益气补虚的黄芪汤在肝硬化的治疗中有较好的疗效和明显特点[3-4]。本课题组前期研究结果显示，黄芪汤可有效改善乙肝肝硬化患者肝功能，缩短门静脉直径，改善食管胃静脉曲张程度[5，10]。

肝纤维化是肝损伤后的修复性应答。各种损肝因素导致肝损伤时，相关细胞分泌多种细胞因子，经旁分泌和自分泌的形式激活肝星形细胞，致使其分泌大量细胞外基质(ECM)，导致ECM的生成大于降解，ECM过度沉积，从而引起肝窦毛细血管化，使肝纤维化形成并进一步发展。肝窦毛细血管化是肝纤维化及肝硬化过程中的一个特征性病变，主要包括肝窦内皮细胞的去窗孔化、表型的改变和内皮下基底膜的形成，使肝脏微循环的功能发生改变并促进肝纤维化的形成，并且与门静脉高压的形成密切相关，因此肝窦内皮细胞在肝纤维化发生、发展中占据重要地位[11-12]。在肝窦毛细血管化病变中，肝窦内皮细胞会表达vWF和血管内皮标志物CD31[13-14],二者是反映肝窦毛细血管化的重要客观分子指标。

本实验结果显示，胆管结扎模型组大鼠出现肝脏功能异常，血清ALB水平显著下降；肝脏组织中假小叶形成，出现大量增生的肝内小胆管，在胆管上皮细胞周围聚集了大量成纤维细胞和堆积的细胞外基质，特别是Col-I大量沉积；肝脏组织中Col-I、CD31和vWF mRNA 相对表达量均明显增高。而黄芪汤各组肝功能指标、肝脏组织病理改变均明显改善，肝脏组织中Col-I和CD31沉积均明显减少， Col-I、CD31和vWF mRNA 相对表达量均明显降低，尤其是黄芪汤高剂量组各指标改善最明显。提示黄芪汤能够下调CD31和vWF的表达，减轻肝窦内皮细胞毛细血管化的程度，从而起到较好的抗肝纤维化作用。

总之，由于肝纤维化、肝硬化病理机制复杂，研究多途径、多靶点的治疗方法将成为发展趋势。综合本实验结果及课题组前期开展的中医药抗肝纤维化、逆转部分早期肝硬化以及改善失代偿期肝硬化肝功能的治疗实践[3，5，10]，说明黄芪汤具有良好的应用和研究前景。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。