赖氨酰氧化酶样蛋白3在人类恶性肿瘤发生、发展中的研究进展

李 彬，朱 泓，黄照能，余 敏，熊 伟

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)家族蛋白是一组铜依赖性胺氧化酶，由5个结构相似的成员组成：LOX和赖氨酰氧化酶样蛋白(lysyl oxidase like,LOXL)1～4[1]。LOX家族蛋白可作用于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的胶原蛋白和弹性蛋白，通过催化赖氨酸和羟赖氨酸残基氧化成肽基醛，使它们之间产生交联，有助于维持ECM的刚性和稳定性。LOX家族各成员的C端区域保守，包含铜离子结合位点，赖氨酸酪氨酰基醌(lysine tyrosylquinone,LTQ)残基和细胞因子受体样(cytokine receptor-like,CRL)结构域为酶的催化区域；但其N端区域则是可变的。LOX家族可根据不同的N端序列分为两个亚家族：第一个亚家族由LOX和LOXL1组成，在肽酶的作用下可被水解，从而形成活性蛋白质和N-末端前肽。第二个亚家族由LOXL2、LOXL3和LOXL4组成，蛋白质N端富含一段含有4个富含半胱氨酸的清道夫受体(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)结构域[2-4]。LOXL3和LOXL2之间的氨基酸序列相似度较高，同源性为69%，而LOXL3与其它成员LOX、LOXL1和LOXL4之间的同源性约为50%[5-6]。LOXL3是LOX蛋白家族中研究相对较少的成员，其铜依赖性胺氧化酶活性最初是基于家族中其它蛋白质成员的同源性而发现的。本文主要从LOXL3蛋白的结构、功能及其人类恶性肿瘤发生、发展的作用进行综述，以期为恶性肿瘤的临床诊断、治疗和筛选预后标志物提供理论基础和参考依据。

1 LOXL3基因和蛋白质的结构

2001年人类 LOXL3基因(ENSG00000115318)分别由3个独立的研究小组通过搜索人类表达序列标签(expressed sequence tag,EST)数据库中，与人类LOX编码基因[6]或小鼠Lor基因的同源基因而被鉴定出来[7]。以上研究中分离的cDNA预测了一种蛋白质，与已经确定的人类LOX、LOXL1和LOXL2蛋白具有相似的结构域。

LOXL3基因定位于2p13.3，由23 462个核苷酸组成，包含14个外显子，全长cDNA为3 121 bp(图1A)。LOXL3基因的5’-侧翼区域位于外显子1，启动子区域没有典型的TATA或CAAT盒，但呈现STAT3、STAT6、SRF MIBP/RFX1、SP1、NF1、NRSF、CRE结合蛋白1、PAX6配对结构域、IRF相关蛋白、GATA结合因子1、NF-κB、GAGA盒、c-Rel位点和AP-2等转录因子的潜在结合位点[8]。LOXL3基因编码最长的全长转录本的开放阅读框编码1个含753个氨基酸残基的蛋白质，其相对分子质量为8.03×104。蛋白质C端包含催化结构域，具有蛋白质构象和催化活性所需的铜离子结合基序，LTQ和CRL结构域[6-7,9]，该催化域在其它LOX蛋白中高度保守，特别是由外显子10、11和12编码的区域。与LOX基因外显子2到外显子9相对应的蛋白质N-末端区域包含4个SRCR结构域，以及位于氨基酸残基25和26之间的一个细胞外信号肽切割位点[6]。根据其预测的结构，LOXL3可以通过骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP1)在ECM中对位点GDD(氨基酸残基446～448位点)进行切割[7]，其加工过程与LOX和LOXL1相似[10]。切割后的相对分子质量为3.5×104，包含306个氨基酸残基[2,7,10]。此外，LOXL3蛋白可以发生糖基化修饰。研究表明，LOXL3蛋白在信号肽序列切割位点之后出现了3个推测的O-糖基化位点(Ser-26、Ser-28和Ser-30)和5个N-糖基化位点(图1B)，这在其他类似LOX的成员中未发现[6]。因此，上述位点的糖基化修饰都可以解释检测到的分泌蛋白质大小的差异。重组LOXL3蛋白是在纤维肉瘤(HT-1080)的浓缩培养基中回收的，其相对分子质量为9.7×104，比预期的分子量大一些，这可能是由于蛋白质的糖基化修饰导致的[6]。此外，LOXL3蛋白也可以通过由两簇碱性氨基酸组成的双核定位信号序列(氨基酸残基293～311)而转位到细胞核，在LOXL3蛋白N-末端区域中也发现了与信号肽重叠的假定核输出信号序列[11-12]。

图1 LOXL3 基因及其编码的蛋白质变体的结构示意图：A.人类LOXL3基因的三个转录本变体的内含子-外显子结构；B.人类LOXL3蛋白变体结构

在人类EST数据库中搜索LOXL3基因表达序列同源物的过程中，还发现两种LOXL3基因的转录本变体，分别为LOXL3-sv1和LOXL3-sv2[8,13]。LOXL3-sv1是最短的转录本，缺少外显子1、2、3和5；外显子4的5′侧翼区域包含额外的80 bp作为替代启动子，外显子14的3′末端侧翼区域包含额外的561 bp序列。与全长LOXL3基因相比，LOXL3-sv1启动子有1个TATA盒以及不同转录因子，如p53、GATA结合因子3、STAT5、Pit1、Ras反应元件结合蛋白1、神经生长素1和3、AP-1、PAX2/5/8、YY1和NUDR的潜在结合位点。该转录本变体的翻译起始于外显子6，编码1个由392个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为4.4×104。尽管缺少前3个SRCR结构域，LOXL3-sv1编码的蛋白质仍然保存C末端和铜离子依赖性胺氧化酶的活性。与LOXL3类似，LOXL3-sv1也可能是BMP-1的靶点，并且有2个推测的N-糖基化位点[8]。最近被鉴定的LOXL3-sv2转录本变体含有12个外显子，缺失与LOXL3基因外显子4和5相对应的序列，导致其编码的蛋白质缺失第2个SRCR结构域。LOXL3-sv2变体编码含有608个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量为6.74×104，具有推测的O-糖基化和N-糖基化位点以及BMP-1裂解位点[13]。尽管LOXL3-sv2变体维持SRCR3结构域，但N端的双核定位信号序列发生缺失。

2 LOXL3蛋白的组织表达和亚细胞定位

2.1 LOXL3蛋白的组织表达对人体的各种正常组织进行Northern印迹分析，结果表明：与LOXL3 cDNA序列长度一致的3.1～3.2 kb的条带，被鉴定为LOXL3 mRNA[6-7]。LOXL3转录本在心脏、脾脏、子宫、髓质、脊髓和卵巢中的表达水平最高[6-7]。使用基因型组织表达(genotype-tissue expression,GTEx)数据库中的正常人类组织RNA表达数据集中分析LOXL3基因的表达水平。研究发现，与文献报道Northern印迹分析的结果一致，LOXL3基因在心脏、脾脏和子宫中呈高表达[14-16]。有研究发现，LOXL3蛋白在肺、主动脉和冠状动脉中高表达，在角膜层、角膜小梁网、眼缘和结膜中也有表达[17]。此外，还有研究表明，LOXL3-svl转录本在肝脏、胰腺、脾脏和胸腺中高表达[8]，LOXL3-sv2转录本在脾脏、睾丸、卵巢、胎盘和小肠中高表达[13]。这些LOXL3转录本变体，在人体正常组织中差异表达的生理意义仍有待阐明。

2.2 LOXL3蛋白的亚细胞定位LOXL3蛋白定位于细胞质和ECM，最初被描述为纤维肉瘤HT-1080细胞分泌到培养基中的蛋白质[6]。有研究表明，LOXL3也可以由心肌细胞分泌，并在ECM的胶原交联中发挥作用[8]。此外，在小鼠模型中也发现LOXL3蛋白对肌腱连接处ECM纤维连接蛋白具有氧化作用[18]。在过表达LOXL3的HeLa细胞、黑色素瘤细胞和Madin-Darby犬肾细胞的核周细胞质中定位观察LOXL3蛋白的表达[19-20]。在HeLa细胞和小鼠脾细胞中也报道核内定位的LOXL3蛋白。此外，在胃癌细胞中也描述LOX蛋白的细胞质和细胞核定位[21]。采用酵母双杂交和免疫共沉淀实验鉴定LOXL3与人类端粒酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)之间具有相互作用，进一步证实LOXL3蛋白的核定位[22]。LOXL3蛋白变体的亚细胞定位仍然需要深入研究。目前，只有一项研究报道LOXL3-sv1亚型在细胞质和ECM的定位[8]，还未有关于LOXL3-sv2蛋白亚细胞定位的报道。

3 LOXL3蛋白的胺氧化酶活性

在LOXL3蛋白的第4个SRCR结构域(图1B)有1个BMP-1切割位点[7]，该加工过程发生在ECM，切割后产生一种具有催化活性的胺氧化酶，其蛋白质C末端的预测相对分子质量为3.5×104。然而，Western blot分析结果表明，从结肠组织中切割出的蛋白质相对分子质量为4.0×104，可能是由于蛋白质翻译后修饰，如蛋白质糖基化所致。研究表明，LOXL3蛋白或其变体对不同类型的胶原蛋白(I、II、III、IV、VI、VIII和X型)以及弹性蛋白均显示胺氧化酶活性(图2)[8]。LOXL3对胶原VIII具有更高的活性，LOXL3-sv1对胶原I、IV和X具有更高的活性[8]，LOXL3-sv2对I型胶原的胺氧化酶具有更高的活性[13]。研究表明，LOXL3的胺氧化酶活性能够被一种有效且不可逆的胺氧化酶抑制剂β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,β-APN)抑制，β-APN抑制细胞基质中蛋白质交联的形成[8,13]。

图2 LOXL3蛋白的胺氧化酶活性

4 LOXL3蛋白在人类恶性肿瘤发生、发展的作用机制

LOXL3蛋白可以与转录因子SNAIL在核周区发生相互作用，阻止SNAIL降解和核输出；而SNAIL可抑制E-cadherin基因转录，诱导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。LOXL3在抑制E-cadherin(CDH1基因编码产物)表达中发挥作用，LOXL3蛋白与核周膜SNAIL的相互作用协同下调CDH1基因的表达，提示LOXL3蛋白参与肿瘤的发展和转移(图3A)。此外，SNAIL蛋白Ser-11位点的PKD1调节，PKD1促进LOXL3的上调及其与SNAIL的相互作用(图3A)。SNAIL蛋白Ser-11位点的磷酸化导致与组蛋白脱乙酰基酶1和2(HDAC1和HDAC2)以及LOXL3结合。SNAIL蛋白磷酸化与HDAC1和HDAC2形成的复合物在细胞核中稳定，并促进肿瘤增殖标志物的上调，如Cyclin D1和AJUBA(图3A)。有研究发现，在黑色素瘤中LOXL3参与肿瘤的发生、发展。LOXL3的上调与黑色素细胞转化中的致癌BRAF途径有关[22]。此外，黑色素瘤中的LOXL3基因表达上调与LOXL3启动子的低甲基化有关。LOXL3基因沉默促进黑色素瘤细胞的DNA损伤反应，双链断裂的积累，导致G2/M期细胞的有丝分裂异常和细胞凋亡逃逸(图3B)。LOXL3与维持基因组完整性和有丝分裂相关的不同蛋白质结合，如BRCA2、RAD51、SMC1A、MSH2、SMC3和NUMA1[22]。以上这些研究结果提示，LOXL3蛋白在黑色素细胞恶性转化和黑色素瘤存活和进展过程中，具有维持基因组稳定性和有丝分裂完成的作用，进而发挥促癌活性。

在队列研究中，Kasashima等[21]通过免疫组化法评估597例原发性胃癌组织中LOXL1、LOXL2和LOXL3蛋白的表达。结果表明：LOXL3蛋白主要表达于细胞核，LOX蛋白家族3个成员的阳性均与肿瘤侵袭、淋巴结转移及患者预后不良密切相关。此外，TGF-β在胃癌细胞中诱导LOXL3上调[23]，表明LOXL3是TGF-β信号通路的下游靶分子，参与细胞的侵袭与转移过程(图3C)。

图3 LOXL3蛋白在人类恶性肿瘤发生和发展中的作用机制

LOXL3在原发性乳腺癌和胸腔积液中均有表达。最近的一项研究中，Jeong等[24]使用免疫组化法检测291例乳腺癌中LOX、LOXL1、LOXL2和LOXL3蛋白的表达；结果表明：LOXL3蛋白仅在13.4%的乳腺癌病例中呈阳性，并与肿瘤内和瘤周炎症、ER、PR和分子亚型具有相关性。LOXL3在其它各种类型的肿瘤中也有表达，如骨髓增生性肿瘤[25-26]和卵巢癌(原发性肿瘤、转移瘤、腹膜和胸腔积液)[27]。卵巢癌患者的血浆中也检测到LOXL3肽段[24]。此外，在结直肠癌患者的循环肿瘤细胞中检测到LOXL3蛋白的表达，其表达量与治疗反应和预后相关[28-29]。最近，Laurentino等[30]研究表明，胶质母细胞瘤是LOXL3表达水平最高的恶性肿瘤，侵袭性是胶质母细胞瘤患者复发和预后不良的主要因素，通过siRNA下调LOXL3基因的表达，可能有助于阻止U87MG细胞的黏附和侵袭。

5 总结与展望

近年对LOXL3蛋白的研究发现，除了铜离子依赖性胺氧化酶的典型功能外，LOXL3蛋白还发挥着多种不同的作用。值得注意的是，LOXL3在胚胎发育和包括胶原蛋白病、纤维化和癌症在内的多种疾病的发病机制中发挥作用，这突出体现了LOXL3作为潜在治疗靶点的重要性[31]。目前，LOX家族的非选择性抑制剂β-APN已被研发，但由于LOX家族蛋白各成员之间的结构相似性以及对其晶体结构缺乏精确了解，使开发特异性的LOX抑制剂成为新的挑战。最近，关于LOXL2/LOXL3双重抑制剂的报道为获得用于治疗目的特定LOXL3抑制剂奠定了基础[32]。为了全面理解LOXL3蛋白在恶性肿瘤发生、发展中的作用，需要解决以下几个问题。(1)大部分的研究是针对肿瘤细胞系中LOXL3基因的下游靶点进行剖析，但LOXL3如何被上游基因进行表达调控及其降解过程仍不清楚。(2)LOXL3-sv1和LOXL3-sv2蛋白在恶性肿瘤中的亚细胞定位及其在肿瘤发生、发展的作用机制亟待深入分析。(3)为了更深入地明确LOXL3基因在肿瘤发生和进展中的作用，应建立基因敲入小鼠和基因敲除小鼠等工程小鼠模型，充分开展实验动物模型的体内研究。(4)需要进一步开发LOXL3单克隆抗体，同时对LOXL3蛋白的小分子抑制剂进行高通量筛选，以发现针对LOXL3基因高表达的人类恶性肿瘤的特异性抑制剂。