非小细胞肺癌中WASF1基因与免疫细胞浸润的相关性分析

仵红娇，刘春玲，金 叶，李 昂，吴凤君，谢俞宁，张 志，张雪梅

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因[1]，2020年全球癌症统计数据显示，肺癌死亡人数约180万例，占恶性肿瘤死亡的18%[2]。我国每年肺癌新发病例约78.7万人，因肺癌死亡人数约63.1万人[3]。肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两种组织学类型，其中NSCLC以肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞状细胞癌(lung squamous carcinoma,LUSC)为主。与SCLC相比，NSCLC细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。近年，肺癌的治疗虽然取得了一定进展，但其预后仍不乐观[4]。WASF1可影响肿瘤细胞的侵袭和迁移，在前列腺癌[5]、黑色素瘤[6]和血癌细胞[7]等多种肿瘤细胞中高表达。目前，WASF1在NSCLC发生、发展中的作用及其潜在的分子机制尚不清楚。本文通过生物信息学分析和分子生物学实验相结合，分析WASF1在NSCLC中的表达及其对NSCLC患者预后的影响，并探讨其可能存在的分子机制，为NSCLC的诊治及预后判断提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015～2016年华北理工大学附属唐山市工人医院存档的NSCLC组织和癌旁正常组织30对，用于qRT-PCR实验。收集2018～2019年华北理工大学附属唐山市人民医院存档的NSCLC组织和癌旁正常组织30对，用于免疫组化实验。

1.2 方法

1.2.1数据库分析NSCLC组织中WASF1 mRNA表达与预后的关系 通过R语言limma软件对TCGA数据库NSCLC(LUAD和LUSC)中WASF1 mRNA表达进行差异分析。使用TIMER数据库[8-10]中Diff Exp模块，评估NSCLC癌组织和癌旁正常组织中WASF1 mRNA表达水平的差异。使用OncoLnc在线数据库[11]分析WASF1 mRNA表达水平对NSCLC患者总生存期(overall survival,OS)的影响。

1.2.2肿瘤免疫细胞浸润分析 TIMER是利用immunedeconv[12]R软件集成了包括TIMER、x Cell、MCP、CIBERSORT、EPIC和quan TIseq等算法，综合使用以上算法对TCGARNA-Seq表达谱数据检测肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况[13-14]。本实验使用TIMER 2.0数据库中的Gene模块分析NSCLC中WASF1 mRNA表达与免疫细胞类型以及肿瘤纯度的相关性；使用SCNA模块探讨WASF1拷贝数与肿瘤免疫细胞浸润的关系[15]；使用Survival模块分析临床结局和免疫细胞浸润或WASF1 mRNA表达之间的关系。

1.2.3GSEA富集分析 使用GSEA软件进行基因富集分析[16]，分析WASF1基因可能参与的信号通路。将置换检验中的随机抽取次数设定为1 000，其它参数均设为默认值。将|NES|>1.0、NOM p-val<0.05、FDR q-val<0.25的基因集，作为显著富集基因集。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR检测 采用Trizol法(Thermo Fisher Scientific,NY,USA)从细胞中提取总RNA，使用RevertAid First Strand cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,NY,USA)将总RNA逆转录为cDNA。使用7900HT Fast Real-time PCR系统进行qRT-PCR反应。WASF1引物序列：上游5′-AAACAAGACCTCAGACATACGTG-3′；下游5′-CTCAGCTCTAGTCAGAAGCTCA-3′。内参GAPDH引物序列：上游5′-ACAACTTTGGTATCGTG GAAGG-3′；下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR反应体系为8 μL，包括4 μL PowerUp SYBR Green Master Mix，10 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，cDNA 0.5 μL(约100 ng)，加去离子水补足至8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸30 s，合计42个循环。

1.2.5免疫组化 采用免疫组化SP两步法进行染色，组织切片60 ℃烤片2 h，经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后，将组织切片浸泡在预热的修复液中15 min。PBS冲洗，加入内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min。PBS冲洗，1% BSA封闭，加入兔抗人WASF1多克隆抗体(北京博奥森生物公司)，于37 ℃孵育60 min。加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，DAB显色。切片经PBS冲洗后，用苏木精对细胞核复染，分化、冲洗返蓝。乙醇脱水，中性树胶封固，镜下观察并拍照。

1.3 结果判断(1)根据阳性细胞百分比进行计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分。(2)根据阳性细胞的染色强度进行计分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相乘：≥3分者为阳性，<3分者为阴性。

1.4 统计学分析使用SPSS 23.0及Graph Prism 6.0软件进行统计学分析。使用配对t检验分析癌组织和癌旁正常组织配对样本WASF1的表达差异。采用Wilcoxon秩和检验分析TIMER数据库中WASF1 mRNA的表达差异，以及拷贝数变异对免疫细胞浸润的影响。通过R语言“Survival”中的coxph函数进行Cox回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC和癌旁正常组织中WASF1 mRNA和蛋白表达使用R语言limma软件对535例LUAD组织和59例癌旁正常组织以及502例LUSC组织和49例癌旁正常组织中WASF1 mRNA表达进行差异分析，结果显示WASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表达均高于癌旁正常组织(P<0.05，图1A、B)。配对LUAD、LUSC组织和对应癌旁正常组织分别有59对和49对。对其WASF1 mRNA表达进行分析，发现WASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表达均高于匹配的癌旁正常组织(P<0.05，图1C、D)。使用TIMER数据库评估WASF1 mRNA在多种肿瘤和正常组织中的表达，结果显示：WASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表达均高于癌旁正常组织(P<0.001,图1E)。

图1 非小细胞肺癌和癌旁正常组织中WASF1 mRNA的表达：A.TCGA-肺腺癌；B.TCGA-肺鳞状细胞癌；C.TCGA-肺腺癌配对组织；D.TCGA-肺鳞状细胞癌配对组织；E.TIMER数据库数据；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

本实验通过免疫组化检测发现，WASF1蛋白在NSCLC组织中的阳性率(70%，21/30)显著高于癌旁正常NSCLC组织(30%，9/30)(图2)，差异有统计学意义(χ2=11.279，P=0.001)。采用qRT-PCR检测30对NSCLC和癌旁正常组织中WASF1 mRNA表达水平，结果显示NSCLC组织中WASF1 mRNA表达(1.46±0.48)显著高于癌旁正常组织(1.00±0.38)(P<0.001，图3A)。

图2 WASF1蛋白在不同肺组织中的表达：A.WASF1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达；B.WASF1蛋白在癌旁正常组织中的表达，SP两步法

2.2 WASF1 mRNA表达与NSCLC患者预后的关系使用OncoLnc数据库分析WASF1 mRNA表达与NSCLC(LUAD和LUSC)患者预后的关系，根据WASF1 mRNA表达水平的中位数将LUAD和LUSC患者分为WASF1 mRNA高表达组和低表达组。结果显示WASF1 mRNA表达水平影响LUAD和LUSC患者的OS，WASF1 mRNA高表达组LUAD患者的OS显著低于WASF1 mRNA低表达组(HR=1.41，95%CI=1.05～1.89，P=0.024，图3B)，而WASF1 mRNA高表达LUSC患者的OS高于WASF1 mRNA低表达LUSC患者的OS(HR=0.68，95%CI=0.52～0.89，P=0.005，图3C)。

图3 WASF1 mRNA表达及其与非小细胞肺癌患者预后的相关性：A.qRT-PCR检测WASF1 mRNA在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达；B.WASF1 mRNA表达与肺腺癌患者预后的关系；C.WASF1 mRNA表达与肺鳞状细胞癌患者预后的关系

2.3 NSCLC中WASF1 mRNA表达与免疫细胞浸润的关系TIMER分析结果显示，LUAD中WASF1 mRNA表达与细胞纯度、B细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的免疫浸润水平无明显相关性(P>0.05)；与巨噬细胞(r=0.131，P<0.01)、中性粒细胞(r=0.207，P<0.01)和树突状细胞(r=0.093，P<0.05)的免疫浸润水平呈正相关。LUSC中WASF1 mRNA表达对B细胞的免疫浸润水平无影响(P>0.05)；与细胞纯度(r=0.275，P<0.01)呈正相关；与CD8+T细胞(r=-0.138，P<0.01)、CD4+T细胞(r=-0.132，P<0.01)、巨噬细胞(r=-0.149，P<0.01)、中性粒细胞(r=-0.247，P<0.01)和树突状细胞(r=-0.186，P<0.01)的免疫浸润水平呈负相关(图4A)。进一步评估浸润的免疫细胞对NSCLC患者临床预后的影响，结果发现：B细胞(Log-rankP<0.001)和树突状细胞(Log-rankP=0.048)浸润水平较高的LUAD患者存活时间越长，预后越好(图4B)；其中B细胞还可以作为LUAD独立预后因素(表1)；而浸润的免疫细胞对LUSC患者预后无影响(P>0.05，表2)。本实验亦发现LUAD中WASF1的拷贝数变异对B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平有影响，LUSC中WASF1的拷贝数变异对B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平有影响(图4C)。以上结果提示，WASF1有可能参与NSCLC细胞的免疫浸润过程。

表1 Cox多因素分析WASF1表达与肺腺癌总生存率相关的免疫细胞

表2 Cox多因素分析WASF1表达与肺鳞状细胞癌总生存率相关的免疫细胞

图4 WASF1表达与肿瘤微环境中免疫细胞浸润之间的相关性：A.WASF1 mRNA在非小细胞肺癌中的表达与免疫细胞浸润水平的相关性；B.免疫细胞对非小细胞肺癌患者临床预后的影响；C.非小细胞肺癌中WASF1的拷贝数变异对免疫细胞浸润水平的影响

2.4 WASF1相关通路富集分析对WASF1可能富集的相关信号通路进行分析，结果显示：与LUAD和LUSC中WASF1高表达相关的基因均富集于细胞周期、核苷酸切除修复和DNA复制等信号通路(图5)；提示WASF1基因可能参与NSCLC发生、发展的多个生物学过程。

图5 GSEA富集分析WASF1调控的相关通路：A.WASF1在肺腺癌中的富集通路；B.WASF1在肺鳞状细胞癌中的富集通路

3 讨论

WASF1在细胞运动中起重要作用，参与细胞的变形和迁移[17]，是肿瘤转移的关键步骤。研究发现，WASF1在前列腺癌细胞和组织中均高表达，敲除WASF1后前列腺癌细胞侵袭性显著降低[5]。WASF1在白血病细胞系中过表达，通过影响BCL-2的磷酸化水平及其在线粒体的定位对细胞凋亡起负调控作用[7]。WASF1可通过调控MMP家族蛋白，促进胶质瘤细胞向周围脑实质转移和浸润。WASF1在上皮性卵巢癌中高表达且与预后不良相关，WASF1可作为上皮性卵巢癌的独立预后因子[18]。WASF1在卵巢癌组织中亦呈高表达，且参与K562细胞的侵袭转移过程。WASF1是连接Cdc42和肌动蛋白细胞骨架的下游分子，可以通过调节细胞背侧皱褶的形成和细胞外基质的降解，参与肿瘤的恶性进程[19]。WASF1在NSCLC组织中表达上调，在不同TNM分期和淋巴结转移中的表达有差异[20]。本实验通过生物信息分析和分子生物学实验，进一步验证WASF1在NSCLC中高表达与患者预后有关，与文献报道一致，提示WASF1基因可作为NSCLC的预后生物学标志物。

近年，肿瘤微环境的免疫逃逸机制及免疫疗法在肿瘤治疗中起越来越重要的作用[21]。肺癌中浸润的免疫细胞可能是预后和免疫治疗反应的重要决定因素，有望成为药物的有效靶点[22]。记忆B细胞缺乏或M0巨噬细胞数量增加与LUAD早期预后不良有关。在LUSC中，T滤泡辅助细胞与良好的预后相关，而中性粒细胞数量的增加预示患者预后不良[23]。本实验发现，LUAD和LUSC中WASF1 mRNA表达水平与多种免疫细胞的免疫浸润水平相关。

最近，有研究报道免疫细胞浸润对NSCLC的临床和预后具有重要作用，将免疫细胞浸润作为特征纳入预后模型，有助于临床医师对患者的预后进行更可靠和准确的预测[23]。肿瘤相关B细胞可以协调并维持黑色素瘤炎症，可能是生存和免疫检查点阻断治疗反应的预测因子[24]。本实验发现B细胞浸润可以作为LUAD的独立预后因素，显著影响LUAD患者的预后。此外，WASF1的拷贝数变异对多种免疫细胞的浸润水平都有影响。这些结果提示，WASF1可能通过影响免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用，从而调控NSCLC的进展。研究发现，WASF1是重要的促自噬蛋白，通过Beclin 1/BCL-2和Beclin 1/pi3k-Ⅲ复合依赖性途径，可能提高白血病细胞的存活率和调节化疗耐药[25]。WASF1在ASK1/JNK依赖性途径中调节BCL-2磷酸化，从而调节线粒体ROS水平和ER Ca2+稳态[7]。本实验发现，WASF1可能参与细胞周期、核苷酸切除修复和DNA复制等信号通路从而影响NSCLC的进展。以上研究为进一步探索WASF1在NSCLC发生、发展中的分子机制提供了基础。研究肺癌发生的分子机制，特别是癌变过程的分子机制，对于提高肺癌早期诊断，降低肺癌发病率和病死率具有重要意义[26]。

综上所述，NSCLC组织中WASF1高表达，影响患者的OS。WASF1 mRNA表达和拷贝数变异可影响多种免疫细胞浸润水平，其可能在免疫浸润细胞中发挥重要作用，并参与细胞周期调控等相关通路。为进一步阐明WASF1在NSCLC中的功能和作用，还需分子生物学实验进行验证和分析。