乳岩宁方联合依西美坦对MCF-7 乳腺癌细胞周期及ERα、p-Akt 表达的影响*

周跃华，高 宏，殷东风

辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳110032

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一［1］。乳腺癌的治疗方法主要有手术治疗、放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等。对于激素受体阳性的乳腺癌患者，内分泌治疗为其重要手段，可延长患者无病生存期（disease free survival，DFS）及总生存期（overall survival，OS），降低复发转移风险。对于绝经后乳腺癌指南推荐芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor，AI）疗效优于他莫昔芬（tamoxifen，TAM），对于绝经前乳腺癌患者合并高危因素，推荐卵巢去势（ovarianfunction suppression，OFS）联合AI 治疗，奠定了AI 内分泌治疗的地位。HIGGINS MJ［2］研究证实将AI 术后辅助治疗延长至10年，可降低乳腺癌复发风险。依西美坦为一种不可逆性甾体芳香酶灭活剂，是常用的AI类药物。但是内分泌治疗带来的副作用如类更年期综合征症状、骨质疏松、血脂异常、关节痛等严重影响患者生活质量，甚至导致放弃内分泌治疗。而中药乳岩宁从“调畅气机”［3］入手，能改善内分泌治疗的副作用［4］及治疗依从性，延长OS［5］。本研究探讨中药复方乳岩宁联合依西美坦对MCF-7(michigan cancer foundation-7，MCF-7)乳腺癌细胞周期及ERα（estrogen receptor α，ERα）、p-Akt(phosphorylated-protein kinase B，p-Akt)蛋白表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株雌激素受体(estrogen receptor，ER）阳性人乳腺癌细胞株MCF-7 购自中科院上海细胞生物学研究所。

1.2 实验动物SPF级雌性BALB/C裸鼠43只，5～6周龄，体质量（20±2）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物实验合格证号：SCXK（沪）2007-0005。

1.3 实验药品及制备乳岩宁的制备：乳岩宁方由柴胡10 g，法半夏10 g，人参15 g，浙贝母15 g，黄芩15 g，炙甘草10 g，生龙骨30 g，生牡蛎30 g，白花蛇舌草15 g，薏苡仁15 g，半枝莲15 g，莪术15 g等14味中药组成，购于辽宁中医药大学附属医院，水煎浓缩至生药浓度为3.3 g/mL 溶液，无菌实验阴性，4 ℃冰箱保存备用。依西美坦片（阿诺新，辉瑞制药，批号：H20120399，规格：25 mg/片）将25 mg 依西美坦片加入62.5 mL 蒸馏水中充分溶解，调节生药浓度至0.4 mg/mL备用。

1.4 主要试剂与仪器细胞周期及细胞凋亡检测试剂盒（PI，碧云天生物，货号：C1062）；兔抗ERα多克隆抗体（北京博奥森生物，批号：909086W）；兔抗p-Akt多克隆抗体（北京中杉金桥，货号：ZA-0105）；OLYMPUS BX41 型数码显微镜（日本OLYMPUS）；FACS CaliburTM 型流式细胞仪（美国BD 公司）；DYY-6C 电泳仪、DYYm40B 型水浴式转印电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.5 实验方法

1.5.1 实验动物饲养 实验动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF 级动物室，动物实验许可证号：SYXK（辽）2013-0009，专人饲养。

1.5.2 去势裸鼠模型制备 采用10%水合氯醛按4 mL/kg 腹腔注射麻醉后将裸鼠四肢固定，俯卧于手术台，背部碘伏消毒，切开皮肤，于脊柱旁开0.5 cm，距肋弓下缘0.5 cm 处切开皮肤、肌肉，剪开腹膜进入腹腔，可见乳白色组织，轻轻提出，即可见粉红色“桑椹样”卵巢，分离后钳夹、结扎，剪去卵巢，检查无渗血后分层缝合皮肤。同样方法切除对侧卵巢，保温20 ℃左右待麻醉苏醒。术后肌肉注射青霉素抗炎，碘伏切口消毒，每日1次，连续3天。

1.5.3 荷瘤裸鼠动物造模 将呈对数生长期的MCF-7 乳腺癌细胞配置成细胞悬液，调整浓度为1×107/mL，取0.2 mL在切除卵巢裸鼠的右腋窝脂肪垫下接种，注射完毕后夹闭针孔片刻，共接种3只，接种后10天左右接种部位处出现白色肿瘤结节，质地较硬，逐渐增大，越长越快。当原代肿瘤长至0.8 cm3大小时手术取下肿瘤，使用骨髓穿刺针原位移植至剩余40只裸小鼠乳垫下，接种后饲养于SPF 级动物实验室，移植第4～5 天后乳垫处即可见肿瘤生长，成瘤率100%，形状、大小较整齐［6］。

1.5.4 动物分组及给药 将40 只造模成功的绝经后荷瘤裸鼠随机分为4 组各10 只，根据人和鼠给药剂量换算公式［7］计算各组给药剂量。模型组：生理盐水每日0.2 mL 灌胃；依西美坦组：依西美坦按4 mg/kg（体质量）给药（相当于临床人用量的10倍），每日0.2 mL 灌胃；乳岩宁组：乳岩宁按33.3 g/kg（体质量）给药（相当于临床人用量的12倍），每日0.2 mL灌胃；结合组（乳岩宁+依西美坦），乳岩宁33.3 g/kg（体质量）+依西美坦4 mg/kg（体质量）每日0.2 mL，连续给药21天。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 流式细胞仪检测乳腺癌细胞周期 将瘤组织用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 小块，越小越好，0.25%胰酶消化，400 目筛网过滤细胞，收集单细胞悬液，碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染法37 ℃避光染色30 min，流式细胞仪上样检测细胞周期，激发波长488 nm，同时采用Multicycle DNA content and cell cycle analysis软件对测量值进行细胞DNA含量分析。

1.6.2 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测瘤组织中ERα、p-Akt 蛋白表达 -20 ℃冰箱中取出肿瘤组织，取标本100 mg，加入500 μL 冰预冷的细胞裂解液，组织匀浆，采用酚试剂法测定蛋白质含量。根据所测蛋白分子量选择相应浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶，灌制12%分离胶与4%浓缩胶，凝胶后上样，电泳，转膜，标记目的条带，封闭，加入特异性一抗，4 ℃杂交过夜；洗液洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，作用1 h，洗涤，碱性磷酸酶法显色，暗室曝光、显影、定影、扫描照相，用Scion Image 软件对蛋白电泳带进行灰度值检测，定量分析。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用单因素方差分（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状态用药第3、5、9 天，结合组、模型组及依西美坦组分别有1 只荷瘤裸鼠出现头部偏向一侧类“中风偏瘫”症状而剔除实验，其余荷瘤裸鼠状态良好，正常自由活动、进食，给药10天后依西美坦组与结合组荷瘤裸鼠皮肤色泽晦暗，进食量减少，精神萎靡，喜蜷卧，依西美坦组最明显；给药第18 天结合组1 只裸鼠因肿瘤消耗死亡，死亡极度消瘦，体质量15 g。乳岩宁组荷瘤裸鼠状态较好，直至实验结束无死亡。

2.2 乳腺癌细胞周期各用药组G0/G1期细胞比例增多，S 期比例减少，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结合组G0/G1期细胞比例最多，S 期细胞比例最少，与依西美坦组及乳岩宁组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。乳岩宁组与依西美坦组比较，G0/G1期、S 期细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1及图1—4。

表1 各组裸鼠移植瘤细胞周期分布情况（）%

表1 各组裸鼠移植瘤细胞周期分布情况（）%

注：☆表示与模型组比较，P＜0.01；★表示与结合组比较，P＜0.01；◆表示与乳岩宁组比较，P＞0.05

图1 模型组乳腺癌细胞周期

图2 依西美坦组乳腺癌细胞周期

图3 乳岩宁组乳腺癌细胞周期

图4 结合组乳腺癌细胞周期

2.3 瘤组织中ERα、p-Akt 蛋白表达模型组中ERα 及p-Akt 蛋白低表达，与3 个用药组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；各用药组均可下调ERα及p-Akt 蛋白表达，其中结合组作用更显著，与乳岩宁组、依西美坦组相比较差异有统计学意义（P＜0.01），乳岩宁组与依西美坦组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、表2。

表2 各组乳腺癌组织ERα、p-Akt蛋白表达灰度值（）

表2 各组乳腺癌组织ERα、p-Akt蛋白表达灰度值（）

注：☆表示与模型组比较，P＜0.01；★表示与结合组比较，P＜0.01；◆表示与乳岩宁组比较，P＞0.05

图5 各组乳腺癌组织ERα、p-Akt蛋白表达电泳图

3 讨论

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞的增殖、凋亡和衰老均依赖于细胞周期的调控。细胞周期调控机制的失活，特别是G1/S 期和G2/M期，在恶性肿瘤发生、发展过程中起至关重要的作用［8］。细胞周期主要有G0/G1期-DNA 合成前期、S期-DNA 合成期、G2/M 期-DNA 合成后期及分裂期。Akt 作为PI3K/Akt 信号通路的下游分子，磷酸化后的AKT 具有多种生物学活性，可促进肿瘤细胞的增殖，促进侵袭和转移，调控肿瘤血管形成，抑制凋亡，产生耐药等［9］。陈子涵等［10］研究表明蒲公英根水提物可通过抑制Akt 活化，激活细胞线粒体凋亡途径，使凋亡相关蛋白（Caspase-9）表达增加，从而促进人乳腺癌细胞株MDA-MB-231（Human breast cancer cell line，MDA-MB-231）细胞的凋亡。

乳腺癌为激素依赖型肿瘤，乳腺癌的发生发展与雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇）关系密切［11］。而雌激素主要与ER 结合后作用于靶组织发挥作用，我们通常认为，ER 阳性患者预后优于ER 阴性患者，雌激素受体的情况是判断预后的指标。同时ER 表达状况可作为乳腺癌化疗敏感程度的一个指标。匡忠生等［12］研究新辅助化疗方案敏感性与ER、孕激素受体(progesterone receptor，PR)及人类表皮生长因子受体2(Human epithelial growth factor receptor 2，HER-2）表达情况，发现ER、PR 阴性或弱表达乳腺癌对CAF(环磷酰胺CTX+阿霉素ADM+氟尿嘧啶5-FU)、CAT(环磷酰胺CTX+阿霉素ADM+多西他赛TXT）方案更敏感。ERα与PI3K/Akt 信号转导通路关系密切，Martin 等研究证实活化的Akt使ERα 中AF-1 区的丝氨酸残基发生磷酸化，从而实现表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1）对ERα的调节［13］。PI3K/Akt 信号通路也可能磷酸化ER，诱导ER 靶点的雌激素非依赖性激活和表达，导致内分泌治疗耐药［14］。本实验发现中药复方乳岩宁联合依西美坦可使p-Akt 及ERα蛋白表达水平下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），结合组作用更显著，与乳岩宁组、依西美坦组比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明乳岩宁联合依西美坦可能是通过下调癌组织中p-Akt、ERα蛋白表达抑制PI3K-Akt 信号通路的活性来抑制MCF-7乳腺癌增殖，也说明ERα与p-Akt 有密切联系。与前期实验研究结果一致，中药乳岩宁联合TAM可以使ERα蛋白表达减少，从而抑制乳腺癌生长［15］。

中医认为乳腺癌的病因病机与抑郁、忧思恼怒等情志因素及冲任失调有关。冯兆张《冯氏锦囊秘录》中曰：“妇人有忧怒抑郁，朝夕积累，脾气消阻，肝气横逆，气血亏损，筋失营养，郁滞与痰结成隐核……积之渐大，数年而发，内溃深烂，名曰乳岩。”乳岩宁方是我科协定处方，从肝入手，将调畅气机理论应用于乳腺癌治疗，从《金匮要略》柴胡加龙骨牡蛎汤加减化裁而来。关于乳岩宁方我们进行了大量实验研究［15-19］。本研究结果显示，各干预措施能延缓MCF-7 乳腺癌细胞的周期进程，结合组效果最明显。乳岩宁组与依西美坦组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明中药乳岩宁与依西美坦合用有协同抗肿瘤的作用。

综上所述，乳岩宁联合依西美坦抑制乳腺癌细胞增殖可能通过改变组织细胞周期进程，下调癌组织中ERα、p-Akt 蛋白表达来抑制PI3K-Akt信号通路的活性来实现，同时乳岩宁与依西美坦有协同作用。本研究未对ERα进行分型研究，今后需对PI3K-Akt下游基因进行深入研究。