三黄凝胶通过调控P38MAPK/ERK 信号通路干预痤疮的作用机制*

郭斐斐，王思农，牛凡琪，刘 婧，牛凡红

甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000

近年来，由多种因素造成体表菌群失调诱发的炎症反应成为痤疮发病机制中研究的重点内容［1］，相关研究表明，从起病阶段的白头、黑头粉刺到中期丘疹和红斑，再到后期色素沉着、痤疮瘢痕的形成，炎症反应贯穿痤疮发病的各个阶段［2］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路可传导刺激信号，介导细胞进行一系列的病理反应［3］。本研究观察三黄凝胶对痤疮大鼠的干预机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级Wistar 雌性大鼠48 只，周龄4～8 周，体质量（180±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供。实验动物许可证号：SCXK（甘）2018-005。喂养条件一致。

1.2 药品与试剂三黄凝胶［含3.6 g（生药）/10 g，院内制剂试生产阶段，由窑街煤电集团有限公司总医院提供］；0.025%维A 酸乳膏（商品名：迪维，重庆华邦制药有限公司，国药准字：H50021817，规格：15 g/盒）；100%油酸500 mL（天津市富宇精细化工有限公司，批号：101212）。磷酸化-细胞外信号调节激酶(P-ERK)试剂盒（上海莼试生物科技有限公司，货号：CS-E02542）；血清磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶P38 抗体（P-P38MAPK）试剂盒（上海白益生物科技有限公司，货号：BY-PD5629S）。

1.3 方法

1.3.1 三黄凝胶制备方法 将三黄膏经验方中的黄芩、黄连、黄柏、苦参、白芷、丹参、紫草等进行低温灭菌，粉碎干燥，制成粗颗粒，过200 目筛，用乙醇做溶剂，用渗漉法提取有效成分溶液，溶液静置24 h 后，过滤，将冰片溶于滤液中，配制成三黄原液。对原液进行脱色处理，将脱色液低温浓缩备用，得三黄浓缩液。加入4.5 倍蒸馏水，再加入40%NaOH 调节pH 至6.0～7.0 制成三黄pH 调节液备用。将4%Cb940、2%月桂氮酮、10%甘油均匀混合制成成胶基质，将三黄pH 调节液、成胶基质、0.2%山梨酸钾、2.0%～2.5%的三乙醇胺均匀搅拌混合，加蒸馏水，即得三黄凝胶［4］。

1.3.2 造模 将48 只大鼠遵循简单排序随机化原则分为6 组，适应环境24 h 后，除空白组外，其余5 组开始造模，造模方法［5］：每只大鼠右耳内侧耳廓导管开口处涂抹100%油酸，每次0.5 mL，每日1 次，连续造模3 周。随机取2 只模型鼠，取鼠耳进行苏木精-伊红染色法（HE 染色）染色及形态学、病理学观察，结果（+）～（+++）表示大鼠痤疮模型造模完成。痤疮组织学判定标准［6］见表1。

表1 痤疮组织学判定标准

1.3.3 分组及给药 根据临床有效剂量与大鼠用药量换算，给药方案：维A酸乳膏组5 g/（kg·d）；三黄凝胶低、中、高剂量组分别用0.02、0.04、0.08 g（生药）/（kg·d）每日1 次，外用涂抹4 周。空白组与模型组外用生理盐水涂抹4 周，每日1次。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠耳廓皮损情况 造模3周后随机取2只模型鼠，切取其造模右耳，HE 染色进行病理学观察，判断造模效果。干预4 周后处死大鼠，切取大鼠造模右耳，HE 染色，进行组织病理学观察。

1.4.2 大鼠血清P-P38MAPK、P-ERK含量测定 干预结束后大鼠心脏采血，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清中P-P38MAPK及P-ERK含量。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠耳廓皮损组织病理学空白组：表皮及角质层未见明显增厚，结构完整，皮脂腺及毛囊未见扩张。模型组：表皮及角质层增厚，颗粒层及棘细胞层增厚明显，毛囊及皮脂腺扩张，角栓堵塞于毛囊内，见大量角化物质堆积，淋巴细胞浸润明显。干预后维A酸乳膏组：表皮及角质层较模型组变薄，毛囊稍有扩大，皮脂腺结构正常，偶见淋巴细胞浸润。干预后三黄凝胶高剂量组：表皮及角质层明显变薄，毛囊及皮脂腺体积缩小，见少量角化物质，淋巴细胞浸润数目减少。干预后三黄凝胶中剂量组：表皮及角质层较模型组变薄，结构完整，皮脂腺扩大，毛囊漏斗部可见少量致密角化物质，淋巴细胞浸润较模型组减轻。干预后三黄凝胶低剂量组：表皮结构完整，增厚明显改善，淋巴细胞浸润减少，毛囊及皮脂腺扩大程度减轻。见图1。

图1 各组大鼠耳廓皮损的组织病理学（HE×100）

2.2 血清P-P38MAPK、P-ERK 含量模型组大鼠血清P-P38MAPK 含量较空白组升高（t=-37.46，P＜0.01）。维A酸乳膏组及三黄凝胶低、中、高剂量组大鼠血清P-P38MAPK含量降低（P＜0.01）。三黄凝胶中、低剂量组大鼠血清P-P38MAPK含量与维A酸乳膏组相比较，差异无统计学意义（t5=-1.46，t6=-2.07，P＞0.05），三黄凝胶高剂量组与维A 酸乳膏组相比较，差异有统计学意义（t=5.09，P＜0.05）。模型组大鼠血清P-ERK含量高于空白组（t=-44.84，P＜0.01）。维A 酸乳膏组及三黄凝胶低、中、高剂量组大鼠血清P-ERK 降低（P＜0.01）。三黄凝胶低、中剂量组与维A酸乳膏组相比较，差异无统计学意义（t5=1.03，t6=-0.18，P＞0.05）。三黄凝胶高剂量组与维A 酸乳膏组相比较，差异有统计学意义（t=9.63，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

表2 各组大鼠血清P-P38MAPK及P-ERK含量（）

注：*表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.01；※表示与维A酸乳膏组比较，P＜0.05。“-”表示等剂量生理盐水

3 讨论

作为人体最大的保护器官［7］，皮肤成为继肠道后第二大复杂的微生态系统，其表面定居各种复杂的细菌、古生菌、真菌和病毒，保持各种微生物共存的动态平衡不仅不会伤害到皮肤组织本身的结构和功能，还能对外来刺激起防御抵抗作用［8］，由于各种体内外因素打破了这种动态平衡，微生物入侵皮肤，导致皮肤及机体发生应答反应，产生各种病理变化。近年来医者越来越重视痤疮丙酸杆菌增殖在痤疮发病过程中的作用［9］，认为痤疮丙酸杆菌的增殖过程打破了皮肤的动态平衡，促进病变发展，痤疮丙酸杆菌表面的肽聚糖（peptidoglycan，PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）激活巨噬细胞表面的炎症信号通路，从而发生一系列炎症反应［10］。P38MAPK 通路是存在于细胞表面的一种促蛋白质磷酸化酶，是MAPK 通路中最重要的一条亚通路［3］，具有参与炎症反应，诱导细胞分化、凋亡的作用，ERK 是重要的信号传导通路，将外来刺激信号传达到细胞核内［11］。痤疮丙酸杆菌过度增殖导致皮肤表面微生态环境被破坏，该通路将信号转导至细胞，引导表皮及真皮细胞进行分化、凋亡，促使淋巴细胞浸润。

中医古籍称痤疮为“粉刺”“酒刺”“面粉皶”“肺风粉刺”等。《黄帝内经》中首次提到风、寒、湿、热之邪促其发病。《外科大成·肺风酒刺》中指出肺卫失调发病及从肺经论治粉刺的观点。后世医家认为粉刺的发病与饮食不洁、胃肠积热；肝气不畅、气机阻滞，郁而化热；肝胃不和，伤及肺脏，发为粉刺。后又提出阴虚发病的观点，认为粉刺发病离不开肾阴气虚，精血不能濡养，外邪复扰，无力抵抗，发为粉刺［12］。五脏失衡发病的观点为后世医家提供了诊治思路。三黄凝胶是在王文春教授的经验方“三黄膏”的基础上加减化裁而成，方中黄芩、黄连、黄柏为君，性味苦寒，泄三焦郁热。黄芩归肺经，清肺热，燥湿凉血，活血散结；黄连归心、脾、肝经，清心泻火，凉血消肝；黄柏归肾经，滋阴泻火，解毒燥湿。从五脏论治，使五脏调达，正气盛则邪去；苦参、丹参苦寒，主清热燥湿，活血凉血，解毒消痈；白芷微温，平和诸药之苦寒，以防诸药寒凉伤及脾胃，兼消肿排脓散结；紫草、冰片活血凉血，通诸窍，畅情志。现代药理研究表明：黄芩的最小抑菌浓度为31.25 mg/mL 时对痤疮丙酸杆菌及表皮金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显［13］。黄连可对抗病原微生物增殖，抑制毛囊扩张，抑制皮脂腺过多分泌油脂，调节面部水油平衡［14］；黄柏可调节皮肤表面菌群失调，促进表皮修复［15］；苦参中所含苦参碱有抗炎、抗病毒、调节机体免疫平衡的作用［16］；白芷中所含欧前胡素、异欧前胡素具有抗炎、抗感染且能软化角质的作用［17］；丹参中含有的丹参酮可抑制炎症细胞趋化性，抑制炎症发展，还可调节体内激素水平［18］；紫草中紫草素可抑菌、抗感染，且能调节人体免疫系统，增强机体免疫能力［19］；冰片在抗炎的同时还增加组方中药的透皮吸收率，2%天然冰片和2%合成冰片对于药物的经皮吸收效果最好［20］。诸药合用清热凉血，活血散瘀，治疗痤疮。

三黄凝胶采用凝胶机制，改进了三黄膏的制备工艺，使药物浓度更高，透皮吸收率更高，增加了药物的有效治疗时间，同时还可减少痤疮患者面部色素沉着及预防痤疮瘢痕的形成。本实验结果表明，三黄凝胶可促进恢复痤疮大鼠模型表皮微生态环境的动态平衡，改善痤疮症状。