基于网络药理学及分子对接发掘当归-川芎药对治疗肺栓塞的作用机制

王坤，王鑫，李琳，张学军

（1.河南省胸科医院心内科，郑州 450003；2.河南省中医药大学第三附属医院中医科，郑州 450003）

肺血栓栓塞症发病率、致残率、致死率高[1-2]。抗凝治疗是其基础治疗法[3]，但肺栓塞病情多变，部分患者仅单纯抗凝治疗可出现临床恶化、遗留慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）可能性大、临床预后差，而增加抗凝药物剂量可增加脏器出血的风险。中医药中当归补血活血，川芎活血行气，二者均为活血药物[4-5]，多用于临床治疗血栓性疾病。但其治疗肺栓塞的机制尚需进一步探索，故本研究利用网络药理学探索当归-川芎药对与肺栓塞的相关性，预测作用靶点，分析作用机制，并利用分子对接技术验证核心成分与重要靶点间的结合性，以期为当归-川芎药对治疗肺栓塞提供理论依据，并为后续治疗肺栓塞中成药的研究与开发拓宽思路。

1 材料与方法

1.1 检索药物成分 将当归、川芎通过TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）网站在线检索其有效药物成分，纳入条件同时满足OB≥30%和DL ≥0.18。将TCMSP 所得药物成分导入PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载药物成分2D 结构。

1.2 获取药物成分靶点 将药物成分2D 结构（PubChem 下载）导入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）网站，得出药物成分作用靶点。

1.3 检索疾病靶点 以“pulmonary embolism”为检索词在GeneCards（https：//www.genecards.org/）网站检索疾病靶点。

1.4 药物-疾病靶点交集 在线分别导入药物成分靶点和疾病靶点至venny2.1 网站，得到药物和疾病交集靶点，即当归-川芎药对治疗肺栓塞的作用靶点。

1.5 靶点间互作网络的分析与构建 在线将交集靶点导入STRING（https：//string-db.org/）网站，进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，设置条件为combined score＞0.4，删除游离靶点，并将数据通过Cytoscape3.7.2 软件处理分析，制作PPI 网络图。

1.6 富集分析 在线将交集靶点录入Metascape（http：//metascape.org/）网站，分别进行GO 生物过程（BP）、GO 分子功能（MF）、GO 细胞成分（CC）富集分析，以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，保留P＜0.01 的数据。

1.7 “药物-靶点-通路”网络 依据药物和疾病靶点及KEGG 分析结果，制作network 及type，将network 及type 导入Cytoscape 软件，分析处理后得到“药物-靶点-通路”网络图，展示药物、靶点、通路网络关系，通过Analyze network 分析网络数据，得出核心成分及靶点。

1.8 分子对接 选取核心成分与其作用的重要靶点进行分子对接。在PubChem 获取对接化合物的3D 结构，在PDB 获取对接靶蛋白及配体的晶体结构，利用AutoDock Tools1.5.6 及AutoDock Vina1.1.2 软件进行分子对接。

1.9 动物实验验证

1.9.1 实验动物和试剂 清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，体重350～450 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，酶联免疫吸附试验试剂盒（南京建成生物工程公司），当归-川芎药物（天津中医药大学第一附属医院提供），聚苯乙烯微球（济南化道新材料科技有限公司），其余实验试剂、耗材均有天津医科大学肿瘤医院实验室提供。所有实验均按照动物伦理规范进行。

1.9.2 实验方法 将20 只SD 大鼠采用聚苯乙烯微球（2.0×106/100 g）右侧颈静脉注射方法，建立肺栓塞大鼠模型，随机将模型大鼠分为两组，即对照组和治疗组，每组大鼠各10 只。治疗组予以50 mg/（kg·d）当归-川芎治疗，对照组予以等剂量水灌胃，治疗14 d 后，采取大鼠血清，酶联免疫法检测血清雌激素受体1（estrogen receptor alpha，ESR1）、肉瘤病毒17 癌基因（JUN）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）蛋白表达。

1.10 统计学处理 采用SPSS 26.0 处理分析。符合正态分布的计量资料采用表示，两组间比较采用t 检验。检验水平α=0.05，P＜0.01 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物成分 当归-川芎通过TCMSP 网站在线检索共获得药物成分9 个，其中当归2 个，川芎7个。将药物成分导入Swiss Target Prediction 预测靶点后筛出8 个药物有效成分。

2.2 药物靶点、疾病靶点及交集靶点 检索后得到84 个药物成分靶点，删除重复靶点，最终得到50 个药物靶点。疾病靶点删除重复靶点最终获得1 172 个靶点。Venny2.1 交集药物和疾病靶点，最终筛出25个共同靶点，即当归-川芎药对通过作用25 个靶蛋白治疗肺栓塞（图1）。

图1 交集靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of intersection targets

2.3 PPI 网络交集靶点 通过STRING 网站和Cytoscape 软件处理并构建PPI 网络图，网络图包含25 个节点和83 条边（图2）。网络图显示靶点间紧密联系，是当归-川芎治疗肺栓塞的关键靶点。

图2 PPI 网络图Fig 2 Protein-protein interaction network diagram

2.4 GO 富集分析 富集分析显示GO BP 331 个，GO CC 13 个，GO MF 40 个。由Log q 值由小到大排列，并分别将BP、CC、MF 前10 富集制作条形图（图3）。

图3 GO 分析柱状图Fig 3 GO enrichment histogram

2.5 KEGG 富集分析 将交集靶点进行KEGG 信号通路分析，共最终获得88 条信号通路，依据Log q 值由小到大排列，并将最相关前10 条通路制作富集气泡图（图4）。

图4 KEGG 气泡图Fig 4 KEGG bubble diagram

2.6 网络图构建 构建药物-靶点-通路网络图（图5）。结果显示，8 个当归-川芎药对的有效成分通过调控不同通路调节25 个疾病靶点治疗肺栓塞。当归-川芎药对治疗肺栓塞的核心成分为β-谷甾醇、豆甾烯醇、杨梅酮、芎萘呋内酯等。当归-川芎药对治疗肺栓塞的核心靶点为CASP3、ESR1、JUN、PTGS2 等（表1）。

表1 核心成分对照表Tab 1 Comparison table of core components

图5 药物-靶点-通路网络图Fig 5 Drug-target-pathway network diagram

2.7 分子对接 将Degree 值排名前4 的核心成分与相作用的重要靶点进行分子对接，分子间的结合能越小，表示其对接性越好，一般结合能≤-5.0 kcal/mol表示具有较好的结合性，最终得出3 种核心分子对接3 个靶点结合性较好（表2，图6），其中Myricanone与PTGS2 结合性最好。JUN-stigmasterol 在氨基酸残基GLN-304 处形成氢键相互作用；ESR1-beta-sitosterol 在氨基酸残基SER-518 处形成氢键相互作用；Myricanone-PTGS2 在氨基酸残基PHE-580 处形成氢键相互作用；Stigmasterol-PTGS2 在氨基酸残基MET-261 处形成氢键相互作用。

图6 分子对接示意图Fig 6 Schematic diagram of molecular docking

表2 核心成分与重要靶点分子对接结果表Tab 2 Docking results of core components and target molecules

2.8 两组大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表达 依据分子对接结果选出结合性较好的靶蛋白ESR1、JUN、PTGS2。酶联免疫检测当-川芎药对治疗肺栓塞大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表达。与对照组相比，治疗组大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表达均增加（均P＜0.01），见表3。

表3 两组大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表达（，ng/mL）Tab 3 Protein expressions of ESR1，JUN and PTGS2 in serum of rats in the two groups（，ng/mL）

表3 两组大鼠血清ESR1、JUN、PTGS2 蛋白表达（，ng/mL）Tab 3 Protein expressions of ESR1，JUN and PTGS2 in serum of rats in the two groups（，ng/mL）

注：ESR1：雌激素受体1；JUN：肉瘤病毒17 癌基因；PTGS2：前列腺素内过氧化物合酶2

3 讨论

当归是一味祖国医学较为常用的活血、补血药，有效成分主要包含植物甾醇类、苯酞类、黄酮类、生物碱类等，主要通过抗血小板聚集、抗氧化、抗炎镇痛等生物学过程发挥治疗作用[4]。川芎是另外一味祖国医学常用活血药物，临床功效为活血行气、止痛祛风，多以挥发油类、黄酮类、甾醇类、生物碱类等成分[5-6]，发挥抗凝血、抗动脉粥样硬化、细胞保护、抗炎、抗氧化等治疗作用。在临床中当归-川芎药对联合应用也较为常见，当归甘辛温，入心、肝、脾经，川芎辛温，入肝、胆、心包经，二者均能活血化瘀，均为血中之气药，二药配伍同用，可增强养血和血、活血祛瘀之功。二者润燥相互牵制，化瘀时不消耗气血，养血又不会导致气滞血壅[7]。总之，当归-川芎药对发挥药理作用和临床功效是以挥发油类、黄酮类、植物甾醇类等有效成分为基础的，能够影响组织缺血的急性损伤，包括抗凝血、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化等过程，同时可以调节血管再生，对于血栓形成及缺血损伤恢复作用有较好的治疗效果。

肺栓塞依据中医证候不同，在中医上多归属于“胸痛”、“厥证”、“胸痹”、“喘证”等范畴[8-9]。中医学认为肺栓塞主要以气滞痰瘀互阻、血瘀气虚、气闭阳脱等病机为主，主要病位在肺、心、肾。历代医者对肺栓塞病因病机的认识有所差异，但是血瘀气滞、痰瘀互阻被多数学者接受，因此治疗多以活血化痰为总治则，并兼以辨证施治。刘建博[10]研究西药溶栓、抗凝联合中药活血化瘀治疗肺栓塞，中药以血府逐瘀汤为基方，依据患者辩证情况，加减施治，疗效较好，较单纯溶栓抗凝，能够降低肺栓塞引起的死亡率。杜玲等[11]研究中西医结合治疗下肢静脉血栓致肺栓塞疗效分析，以溶栓和中药活血化瘀、化痰为主要治疗手段，发现在治愈率和死亡率上，中西医结合治疗均优于溶栓治疗。王峰等[12]用丹蛭通脉方联合抗凝治疗肺栓塞，可以改善患者右心功能以及中医证候，并且减少出血风险。韩丽等[13]研究抗凝溶栓联合自拟逐瘀养肺方治疗肺栓塞，发现中医药联合治疗能够更好地改善血液黏滞性与流动性，促进阻塞血管复通，恢复血氧供应，降低肺动脉压，改善肺栓塞患者预后。当归和川芎是补血、活血药物，临床多用于治疗血瘀性疾病，这与肺栓塞的核心病因病机相契合。并且多数治疗肺栓塞中医药组方中均使用当归和川芎。

本研究筛选核心药物成分4 个，其中当归2 个核心成分，分别为β-谷甾醇、豆甾烯醇，川芎2 个核心成分，分别为杨梅酮、芎萘呋内酯。β-谷甾醇、豆甾烯醇二者为植物甾醇类物质。β-谷甾醇一种植物类固醇，是动植物细胞膜重要的组成之一，具有降胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和类激素功能等多种生物活性[14]。研究显示β-谷甾醇能够调节脂代谢途径，从而保护组织缺血再关注损伤[15]。豆甾醇可以清除氧自由基，具有明显的抗氧化作用，能够减少缺血损伤后的氧化应激[16]。杨梅酮是黄酮类化合物，具有抗血小板聚集、抗凝、抗炎、降血糖及保护神经等药理作用[17]。方晴霞等[18]研究显示，杨梅酮能够降低血小板聚集，减少血栓形成。Chen 等[19]研究显示，杨梅黄酮能够明显抑制过氧亚硝酸盐诱导的DNA 断裂，减少羟基自由基形成，进而降低神经病变。夏淑芳等[20]研究显示，杨梅黄酮能够调节脂代谢，预防脂肪肝。缺氧诱导因子（HIF）-1 信号通路在机体对低氧浓度的应答中至关重要，是缺氧状态下的主要调节因子。最近的研究表明，HIF 信号通路不仅可以通过降低氧气利用率来诱导一系列的适应性反应，而且在细胞损伤后发挥保护作用[21]。

综上所述，当归-川芎药对可以用于治疗肺栓塞，主要通过调节HIF-1、脂代谢、神经变性等信号通路的ESR1、JUN、PTGS2 等疾病靶点，干预酶的活性、抗血小板聚集、抗凝等生物学过程，进而治疗肺栓塞。