环介导等温扩增法与重组酶聚合酶扩增法用于孕妇B族链球菌定植筛查的价值
2022-09-27马小波梁朝霞何玉萍刘鸿飞
马小波,梁朝霞,吴 勇,何玉萍,刘鸿飞,董 艳
1.江苏省南京市高淳中医院检验科,江苏南京 211300;2.徐州医科大学附属沭阳医院检验科,江苏沭阳 223600;3.徐州医科大学附属沭阳医院妇产科,江苏沭阳 223600
B族链球菌(GBS)定植是发生早发型新生儿败血症的主要原因[1]。GBS定植具有起病隐匿、症状不典型的特点[2]。多方共识指出:孕35~37周进行直肠及阴道GBS定植筛查有助于减少产妇分娩风险及新生儿感染风险[3-5]。GBS定植的筛查临床上多以培养法作为判断GBS定植的金标准,但培养法多需要48 h以上,其耗时长、灵敏度差[6]。聚合酶链反应(PCR)或荧光PCR虽然能够减少鉴定时间,已经逐渐取代培养法成为新型筛查方式,但其对仪器及设备的成本需求相对较高,不适合中小型医院应用[7]。环介导等温扩增法(LAMP)的反应时间仅需几十分钟,反应结束可通过肉眼直接观察,简单、高效[8]。重组酶聚合酶扩增法(RPA)能在15 min内进行DNA扩增,但缺乏有效的直接观察方式[9]。两种方法均属于恒温环境下来进行DNA扩增的有效方式,简单、方便。为进一步明确LAMP及RPA用于孕妇GBS定植筛查的价值故进行本研究,现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择2018年5月至2019年7月在徐州医科大学附属沭阳医院(以下简称该院)采集的68例孕35~37周孕妇阴道及直肠拭子作为主要检测标本。纳入的孕妇在4周内未进行抗菌药物治疗。取孕妇肛周分泌物及阴道下三分之一处分泌物等分为3份,标记后进行孕妇GBS定植筛查。
1.2仪器与试剂 PCR仪(含染料,上海星汉生物科技有限公司,型号:2×Taq MasterMix)、高速离心机(常州市亿能试验仪器厂,型号:TG16G)、电泳仪(南京普阳科学仪器研究所,型号:LG4C0818)、凝胶成像仪(赛默飞世尔科技公司,型号:E-Gel Imager凝胶成像仪-紧凑型凝胶成像系统)、恒温水浴锅(苏州珀西瓦尔试验设备有限公司,型号:TZL-5002)、核酸染料(上海抚生实业有限公司,型号:SYBR GreenⅡ)。LAMP试剂盒(苏州天隆生物科技有限公司,国械注准20193400369)、RPA反应试剂盒(广州市宝创生物技术有限公司,国械注准20213400530)、TwistAmp®LF免疫金试纸条(广州市微米生物科技有限公司,国械注准20193400250)。
GBS标准菌株选择购自上海素尔生物科技有限公司的无乳链球菌ATCC13813菌株作为阳性菌株;将该院培养的化脓性链球菌、肺炎链球菌、星座链球菌、金黄色葡萄球菌、F组链球菌各1株作为阴性菌株。
1.3方法
1.3.1标本的处理 将采集的孕妇阴道及直肠拭子置于1 mL无菌蒸馏水中,10 000 r/min高速振荡60 s,10 000×g离心300 s,弃去上清液;再加入0.1 mL无菌蒸馏水中沉淀后,再次离心,弃上清液;再加入0.1 mL无菌蒸馏水重悬沉淀后依据沸水浴法提取DNA,一份行LAMP检测,一份行RPA检测,另一份行16s rRNA测序,应用GenBank数据比对确定细菌DNA。
1.3.2DNA提取方法 应用移菌环自血平板上刮取培养完成的菌株,置入0.1 mL的无菌蒸馏水中,在沸水中水浴10 min,10 000×g离心2 min(分离线粒体),取上清液备用,作为模板DNA(ATCC13813菌株为阳性模板,其他菌株为阴性模板)。
1.3.3LAMP 将LAMP试剂盒中的反应液、显色液FDR和2 μL的模板DNA置入0.5 μL的PCR管中,混合均匀,再置入63 ℃的恒温水浴锅中反应0.5~1.0 h后取出,置入判定结果。
1.3.4RPA 严格按照RPA试剂盒说明书进行操作,RPA反应体系(47.5 μL):10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL,DNA模板2 μL、重组缓冲液29.5 μL,超纯水11.2 μL制成混合液。将混合液移入预装好冻干粉的反应管中,混合均匀后加入2.5 μL MgAc,使最终反应体积达到25 μL,置入PCR扩增仪,运行20 min。运行4 min时,取出PCR管,轻弹并混匀,再放回38 ℃的恒温仪中继续孵育。运行结束后将扩增产物取出12.5 μL置入新的EP管中,后续经DNA纯化及琼脂糖凝胶电泳,并将余下的孵育产物进行TwistAmp®LF免疫金试纸条检测。
1.3.5判定方法 LAMP结果判定:以反应液变为绿色作为阳性结果,反应液无变色为阴性结果。RPA结果判定:以出现反应条带为阳性结果,无反应条带为阴性结果。本研究以ATCC13813菌株检验结果为阳性对照组,其他标本为阴性对照组,并以16s rRNA测序结果为金标准。
1.3.6评估方法
1.3.6.1灵敏度评估 取无菌双蒸馏水对待测模板DNA做10倍梯度递减稀释,并以模板DNA检验情况最低浓度判断。同时对比不同检测方法的阳性结果准确率。
1.3.6.2特异性评估 以阴性菌株为模板,应用LAMP、RPA检测,并进行评估,以确定LAMP、RPA对GBS的诊断特异性。
1.3.6.3时效性评估 采集自开始检验至检验结果产生的时间差进行比较,确定两种检验方法的时效性差异。
1.3.7观察指标 观察LAMP及PRA的最佳引物、反应条件、反应时间及检测的灵敏度、特异性。
2 结 果
2.1LAMP和RPA的最佳引物和反应条件对比 本实验自5组LAMP引物中选择一组反应迅速、特异性高的引物作为最佳引物,该引物最佳反应条件:63 ℃,反应45~60 min。反应45 min时,LAMP检测管颜色自橙色逐渐转为绿色标本为阳性,延长时间至60 min无颜色变化,阴性标本为橙色。RPA的引物以F3、B3为主,其最佳反应温度为38 ℃,恒温15 min。见表1。
表1 最佳引物序列
2.2两种方法的灵敏度及特异性对比 经LAMP及RPA检测,45 min时,ATCC13813菌株DNA模板水平在0.01~10.00 ng/μL时,两种检测方法均能够有效筛查阳性标本,检验极限均为0.01 ng/μL。经LAMP及RPA检测确定,而对于阴性菌株可以明确排除。两者的特异性一致。见表2。
表2 LAMP及RPA特异性比较
2.3两种方法的时效性及准确性对比 68例标本中共6例阳性、62例阴性,GBS定植率为8.82%。LAMP共耗时69 min,LAMP测定仅需要恒温仪即可判读;RPA测定68例标本,共耗时130 min,需要使用恒温仪、电泳仪和凝胶成像仪或免疫金试纸条才能产生准确结果。两种检测方法临床准确性比较,LAMP共检出6例阳性、62例阴性,与16s rRNA测序结果完全一致;而RPA电泳法共检出7例阳性(假阳性1例),61例阴性;RPA免疫金试纸条检测与LAMP测定结果一致,仅需20~30 min即可完成。
3 讨 论
GBS定植筛查已经成为发达国家对孕35~37周筛查的主要指标之一。研究显示,孕晚期妇女GBS定植率为15.58%,以30~40岁孕产妇多见[10]。这一结果与本研究纳入标本的GBS定植率8.82%(6/68)大致相当[11]。我国民众对GBS的了解少,故GBS定植筛查的普及率相对较低;而且受到筛查时间、筛查技术难度及费用昂贵的限制,多数孕期妇女对GBS认识不足,难以建立有效的GBS定植筛查机制[12]。随着GBS DNA诊断技术的发展,PCR技术逐渐成熟,但是在中小型医院由于经费等原因仍难以普及[13]。
LAMP及RPA能够减少早期筛查成本,降低筛查时间损耗,灵敏度高、特异性好,与PCR技术相比,经济价值及诊断效能更佳。与传统PCR技术相比,LAMP及RPA更加快速、方便,且对设备需求度低[14]。LAMP采用6个不同区域靶基因制订4条特殊引物,经过起始及循环扩增形成最终的花椰菜样茎-环状结构DNA混合物[15]。在LAMP反应过程中,焦磷酸镁沉淀作为主要副产物存在,使得肉眼能够有效分辨荧光染料,具有可视性,但LAMP的引物设计较为复杂,在一定程度上限制了其临床应用程度[16]。
RPA与LAMP相比,反应温度更接近人体体温,在37~42 ℃进行,单链核酸重组酶UvsX与引物相结合,利用Bsu DNA聚合酶实现链置换,在这个置换过程中,引入单链DNA结合蛋白Gp32核酸蛋白形成复合体,在多种因子共同作用下,基因链的延伸与配对过程才能实现[17]。但由于反应情况无法进行视觉诊断,多应用凝胶电泳成像技术进行定性检测,但低浓度模板可能出现非特定信号污染,其诊断时效性及准确性较低[18]。但结合免疫金试纸条技术能够减少低浓度模板的信号污染,避免假阳性标本产生,且基因扩增完成后即可进行检测,显像仅需5 min,有效地弥补了RPA在GBS定植筛查过程中的缺陷[19]。
本研究结果发现,LAMP的基因扩增对设备需求更低,适合基层医院应用;而RPA扩增后应用免疫金试纸条进行定性检测,耗时更短,且结果与LAMP一致,虽然增加一定的检验成本,但节约检测时间,适合中型以上医院选用[20]。LAMP和RPA(免疫金试纸条判读)的灵敏度及特异性一致。
综上所述,LAMP及RPA对设备依赖程度较低,RPA基因扩增速度快,LAMP总耗时相对较短,且具有可视性,RPA扩增后采用免疫金试纸条方式诊断灵敏度及特异性与LAMP一致,两种方法均具有简单、高效的特点,适用于孕妇GBS定植筛查。