基于ceRNA网络筛选卵巢癌铂类药物的耐药基因及临床验证

马文娟，苏 琦

陕西省西北妇女儿童医院药剂科，陕西西安 710061

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，调查显示卵巢癌发病率地域性明显，卵巢癌早期检出率低，超过40%患者被确诊时已处于中晚期[1]。化疗在卵巢癌中得到广泛应用，已成为卵巢癌治疗的重要方法，其中铂类药物被指南推荐为一线治疗药物[2]。但铂类药物的耐药问题逐渐突出，影响化疗效果和患者预后[3]。目前，临床认为铂类药物耐药是由多基因、多因素共同作用的结果，与DNA损伤、DNA分子通路密切相关[4]。长链非编码RNA(lncRNA)自cDNA测序被发现以来，其在卵巢癌细胞生长、转移、侵袭及增殖中的作用被证实，还有研究显示lncRNA可与RNA结合蛋白相互作用，参与卵巢癌耐药[5]。近年来有学者提出竞争性RNA(ceRNA)概念，即具有相同miRNA应答元件的mRNA、lncRNA等转录物通过竞争性结合参与调控细胞功能，发挥生物学功能[6]。本研究采用细胞生物学方法建立ceRNA调控网络，探讨其在筛选卵巢癌铂类药物耐药基因中的价值，并验证其可行性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年4月至2020年4月在本院治疗的64例卵巢癌铂类药物耐药患者作为耐药组，患者平均年龄(48.09±13.37)岁；按国际妇产科联盟(FIGO)分期，Ⅲ期42例，Ⅳ期22例；肿瘤平均最大径(4.36±1.02) cm。另纳入同期在本院治疗的64例对铂类药物敏感的卵巢癌患者作为对照组，患者平均年龄(47.71±12.85)岁；按FIGO分期，Ⅲ期37例，Ⅳ期27例；肿瘤平均最大径(4.50±0.94)cm。两组患者一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获本院伦理委员会审批同意。所有患者均知悉本研究内容，签署知情同意书。

纳入标准：(1)铂类耐药诊断参照FIGO和美国国立综合癌症网络(NCCN)指南标准[7]。耐药，即接受规范化疗达到临床缓解目标，完成化疗后复发时间<6个月；敏感，即接受规范化疗达到临床缓解目标，完成化疗后6个月内无复发。(2)患者均接受手术+化疗治疗，并通过手术病理检查确诊为卵巢癌。(3)临床资料完整。(4)患者年龄≥18岁。

排除标准：(1)妊娠或哺乳期患者；(2)精神意识障碍者；(3)肝肾功能严重不全或有严重心肺基础疾病者；(4)合并有其他恶性肿瘤者。

1.2方法

1.2.1构建ceRNA调控网络 利用PubMed数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)在线检索与卵巢癌铂类药物耐药相关的lncRNA文献，再分别利用RNA Locate与LncATLAS在线平台分析定位lncRNA位置，以DIANA-lncBase和miRcode在线平台分析记录与lncRNA结合的miRNA，并采用miRTarBase在线工具分析miRNA靶向mRNA。以DAVID在线平台进行基因本体(GO)功能注释，并行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以综合得分>10分、P<0.01为标准，记录差异有统计学意义的基因。采用ceRNA预测数据库在线平台(http://www.bio-bigdata.net/miRSponge)构建ceRNA调控网络。

1.2.2临床检验验证 取两组患者手术病理标本1.0～3.0 cm，取新鲜组织标本切片至直径2～5 mm，置于EP管，存于液氮罐中备用。根据ceRNA调控网络构建的结果，采用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测ceRNA网络中关键lncRNA的水平，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供，以GAPDH作为内参对照，以2-ΔΔCt计算基因水平。

1.2.3生存预后观察 患者化疗结束后进行随访，随访以电话和入院复诊形式进行，每2周电话随访1次，以发生肿瘤进展为随访终点，记录并比较不同HOTAIR和SOX2水平卵巢癌患者无进展生存(PFS)率。

2 结 果

2.1与卵巢癌铂类药物耐药相关的lncRNA 通过PubMed数据库筛选与卵巢癌铂类药物耐药相关的lncRNA：上调12个，包括lncRNA ORM1、lncRNA ITPA、lncRNA HOTAIR、lncRNA DEPDC7、lncRNA IMPDH2、lncRNA AKAP12、lncRNA HULC、lncRNA SLIT3、lncRNA PDE4D、lncRNA NRF2、lncRNA SOX2及lncRNA BRCA2；下调5个，包括lncRNA GPX3、lncRNA CAIR、lncRNA HCP5、lncRNA PRKDC及lncRNA LAMP3。

2.2构建卵巢癌铂类药物耐药相关ceRNA调控网络 经亚细胞定位显示，有6个lncRNA与铂类药物耐药相关，且均存在于细胞质中，见表1。lncRNA-miRNA调控预测显示，miR-148b-3p、miR-130a、miR-34a、miR-218-5p、miR-362-3p、miR-183-5p、miR-183、miR-145、miR-126、miR-1696、miR-921、miR-17、miR-185共13个miRNA与lncRNA分子存在靶向结合关系。根据GO和KEGG分析结果构建ceRNA调控网络，结果显示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2是ceRNA网络中两个关键的lncRNA，其中lncRNA HOTAIR与miR-148b-3p、miR-130a、miR-519d及OCT4、HRAS、XIAP组成ceRNA网络，lncRNA SOX2与miR-302、miR-429、miR-140-3p及EGFR、ABHD2、ALDH1构成ceRNA。故临床验证中主要检测lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2两个基因。

表1 定位于细胞质的6个lncRNA

2.3两组患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2相对表达量的比较 耐药组患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2水平分别为2.72±0.58和1.45±0.37，明显高于对照组的1.92±0.49和1.26±0.40，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判断卵巢癌铂类药物耐药及患者预后的价值 ROC曲线分析显示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2对判断铂类耐药具有一定的应用价值(AUC>0.75，P<0.05)。见图1和表2。128例卵巢癌患者中lncRNA HOTAIR<2.350者59例，10例肿瘤进展，1年PFS率为83.1%；lncRNA HOTAIR≥2.350者69例，24例肿瘤进展，1年PFS率为65.2%。lncRNA SOX2<1.325者68例，13例肿瘤进展，1年PFS率为80.9%；lncRNA SOX2≥1.325者60例，21例肿瘤进展，1年PFS率为65.0%。lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者PFS率差异有统计学意义(Log-rankχ2=5.501、4.054，P=0.019、0.044)，见图2、3。

图1 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判断卵巢癌铂类药物耐药的ROC曲线分析

表2 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判断卵巢癌铂类药物耐药的ROC曲线分析结果

图2 不同lncRNA HOTAIR水平患者1年PFS率比较

图3 不同lncRNA SOX2水平患者1年PFS率比较

3 讨 论

目前有关卵巢癌铂类药物耐药机制已深入分子领域，研究证明基因参与跨膜转运、DNA损伤修复、信号通路传导及肿瘤细胞增殖等多种生物学行为[8]。lncRNA属非编码RNA，可通过调控基因表达参与染色体修饰、蛋白质折叠及细胞信号通路调节等过程，lncRNA还可经其二级结构与蛋白质核酸结合，进而调控肿瘤细胞分裂、凋亡[9]，在肿瘤耐药中发挥重要作用。而ceRNA包含miRNA和miRNA应答元件，可通过与lncRNA结合，调控基因表达[10]。ceRNA调控网络由ceRNA-miRNA-mRNA构成，在该网络中，各RNA分子间可竞争性结合miRNA，拮抗miRNA对编码基因的抑制作用，从而达到相互调控、维持基因表达稳定的目的[11]。因而，通过ceRNA调控网络有助于进一步深入探讨肿瘤耐药机制。

亚细胞定位、miRNA及MRE序列与ceRNA调控网络效能密切相关。本研究通过RNALocate和lncATLAS在线平台对与卵巢癌铂类药物耐药相关的lncRNA进行定位，并在此基础上进行关联分析，挖掘与铂类耐药相关的关键lncRNA，构建ceRNA调控网络，进而通过临床试验进一步证实关键lncRNA与铂类药物耐药及卵巢癌患者预后的关系，为今后靶向治疗提供依据。本研究结果发现lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2是关键的ceRNA分子，在ceRNA调控网络中发挥重要作用，lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2异常高表达将增加卵巢癌铂类药物耐药风险，且降低PFS率。通过监测lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2水平，并指导临床早期干预，将有助于避免耐药及提高治疗效果。

lncRNA HOTAIR是首个被发现的具有反式转录作用的lncRNA，具有特异性双向结合功能，并与PRC2、LSD1等形成复合体，产生级联效应[12]。lncRNA HOTAIR已被证实在卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，而沉默lncRNA HOTAIR能显著抑制卵巢癌细胞侵袭、增殖[13]。本研究结果显示lncRNA HOTAIR定位于卵巢癌细胞质和细胞核中，提示其可能在卵巢癌铂类药物耐药中发挥关键作用。NADAL等[14]也发现lncRNA HOTAIR可能通过调节p21WAF1/CIP1，增强肺腺癌对铂类药物的耐药性。FAYDA等[15]则证明lncRNA HOTAIR表达水平与p21 mRNA呈负相关。本研究显示lncRNA HOTAIR可能通过抑制miR-519d，靶向作用于XIAP、OCT4。同时，lncRNA-miRNA-mRNA这一调控网络能更清晰阐述lncRNA HOTAIR参与卵巢癌铂类药物耐药的机制。本研究发现lncRNA HOTAIR作为ceRNA，可与mRNA竞争miRNA-148b-3p结合位点，影响mRNA表达，进而干扰其对靶基因的调控，参与耐药。lncRNA SOX2属于干细胞标志蛋白，韩玲等[16]的研究显示lncRNA SOX2过表达可促进卵巢癌细胞迁移、增殖，基础研究还证明lncRNA SOX2可调控MMP-9、FN1活性，促进肿瘤转移，而敲除lncRNA SOX2则可增加肿瘤细胞凋亡，降低化疗敏感性[17]。本研究显示lncRNA SOX2可靶向作用于与耐药相关的miR-302、miR-429及miR-140-3p，进而调控EGFR、ABHD2。因而，推测lncRNA SOX2可能通过调控EGFR和ABHD2参与卵巢癌铂类药物耐药。

lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2在ceRNA网络中发挥关键作用，为进一步证实上述结果，本研究收集对铂类药物耐药与敏感的卵巢癌各64例，采用RT-PCR法检测lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2在铂类药物耐药与敏感癌组织中的表达量，对比分析二者对判断耐药的价值，并观察lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者的预后。本研究结果显示lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2判断铂类药物耐药的AUC分别为0.875和0.750，提示检测癌组织lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2水平有助于铂类耐药的早期筛查，这对于指导临床用药具有较高应用价值。另外，lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者1年PFS率差异显著，这一结果说明lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2有助于判断卵巢癌患者预后，逆转lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2水平有助于改善PFS率，这将为今后临床靶向治疗提供新的方向。但癌组织lncRNA HOTAIR与lncRNA SOX2检测可重复性差，是否可采用血清指标替代癌组织作为试验标本用于耐药和预后判断，还有待于今后进一步研究证实。

综上所述，ceRNA网络有助于筛选卵巢癌铂类药物耐药相关基因，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2与卵巢癌铂类药物耐药密切相关。