全身正弦波交变电磁场对于高糖高脂饮食2型糖尿病大鼠神经病理性疼痛的影响*

胡国花，蔡 婧，兰 娜△

1.陕西省西安市西电集团医院麻醉科，陕西西安 710077;2.空军军医大学生物医学工程系，陕西西安 710032

糖尿病是全世界发病率最高的慢性非传染性疾病，目前全球约有4.5亿糖尿病患者，而我国糖尿病患者高达1.2亿[1]。我国是全球糖尿病第一大国，糖尿病已成为制约我国社会经济发展的一个重要医学问题[2-3]。糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和其他类型糖尿病4种，其中T2DM占糖尿病发病总人数的90%以上，是最主要的糖尿病类型。T2DM患者因长期存在的高血糖状态，会诱发机体包括心脏、神经、眼、肾脏的慢性损伤[4]。神经病理性疼痛是T2DM最常见的慢性并发症，有近50%的T2DM患者会发生神经病理性疼痛，临床主要表现为自发痛、诱发痛、痛觉过敏、痛觉超敏和异常性疼痛[5-6]。目前，临床对于T2DM神经病理性疼痛尚无有效的治疗对策，而常用的镇痛药、抗焦虑药、抗炎药和神经营养类药物，不仅疗效难以令人满意，并且还存在着高药物不良反应和耐药性的问题[6-7]。交变电磁场治疗是目前临床常见的物理治疗方法，其积极疗效已在骨骼肌、皮肤及心血管相关疾病中得到了充分证实[8-9]。也有学者们发现交变电磁场具有明显抑制疼痛的作用[10-11]。但是，交变电磁场治疗对于糖尿病神经病理性疼痛(尤其是T2DM神经病理性疼痛)的作用效果，目前鲜见被系统阐明。本研究通过链脲佐菌素(STZ)联合高脂高糖饮食法构建T2DM动物模型，系统探讨交变电磁场辐照疗法对于T2DM神经病理性疼痛的作用效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 3月龄雄性SD大鼠30只，SPF级，购于空军军医大学实验动物中心。

1.2仪器与试剂 链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司；血糖分析仪购于美国Lifescan公司；von Frey丝购于美国Stoelting公司；热痛敏刺激和测量系统购于意大利Commat公司；cDNA反转录试剂盒购于北京天根生物技术公司；Maxima SYBR Green qPCR试剂盒购于美国Thermo公司；总RNA提取试剂Trizol购于美国Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1实验设计 实验大鼠饲养于温度为(23±1)℃、湿度为(55±5)%及每日光照12 h的动物实验室。使用STZ联合高脂高糖饲喂法构建T2DM动物模型，具体步骤：SD大鼠使用高脂高糖饲料(包含10%猪油、10%蔗糖、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%蛋黄粉)饲养4周，随后行过夜禁食处理，次日清晨通过腹腔注射浓度STZ缓冲液(35 mg/kg)，继续高脂高糖饮食饲养4周，使用血糖仪测量大鼠随机血糖值，血糖>16.7 mmol/L并表现出多饮、多食、多尿的“三高”症状的大鼠被认定符合T2DM标准。整个实验共分为3组，分别为空白对照组(对照组)、T2DM组及T2DM交变电磁场治疗组(T2DM+EMF组)，每组10只。给予对照组大鼠常规(非高糖高脂)饮食；对T2DM+EMF组大鼠施加全身性的正弦交变电磁场暴露8周，每周1 h；对照组和T2DM组大鼠同样放入电磁线圈中，但不施加电流，作假暴露处理。

1.3.2交变电磁场发生系统 交变电磁场发生系统主要包括电信号发生器和Helmholtz线圈两部分。电信号发生器以MSP430单片机为核心，负责输出正弦波交变弱电信号，对产生的波形、频率、强度等参数进行控制，并负责捕获键盘的输入信号，按用户设定的命令进行输出，该弱电信号经过信号调制、整流、滤波和放大处理后，将信号输出至Helmholtz线圈。Helmholtz线圈包含2个直径相同(线圈间距40 cm)且等轴放置的线圈组，线圈匝数为100，线圈间距20 cm。实验动物饲养于塑料笼中，动物身体与线圈中轴线在同一水平面。实验所产生的交变电磁场峰值强度为5 mT，频率为50 Hz。

1.3.3机械痛阈值测定 在交变电磁场治疗的第0、2、4、6、8周，分别对各组大鼠进行足底机械痛阈值的测定。测量前，将大鼠放置于金属网中，其上方设有透明树脂玻璃罩，令大鼠充分适应环境30 min。待充分安静后，使用Von Frey纤维丝刺激大鼠后足中央，刺激过程中或移开纤维丝瞬间，大鼠出现明显的抬足、躲避、舔脚等反应，将此次测量定义为阳性，记录动作发生的时间。每一标号的纤维对每侧足底刺激5次，即双侧10次，如出现5次以上阳性反应，则记录该纤维力度。如果发现实验动物出现5次不抬腿的情况，则更换更高刻度的纤毛。

1.3.4热痛阈值测定 在交变电磁场治疗的第0、2、4、6、8周，分别对各组大鼠进行足底热痛阈值的测定。测量前，将大鼠置于独立的有机玻璃笼中，令其充分适应30 min。使用热辐射测痛仪对大鼠足底中部行热光束照射，大鼠因无法耐受热痛出现抬足反应，此时光束会自动切断并自动记录反应时间。每只大鼠的每侧足底共刺激5次(双侧共10次)，每次间隔10 min，记录10次测量值并取其平均值。

1.3.5脊髓细胞因子基因表达测定 交变电磁场干预8周后，通过使用腹腔注射过量戊巴比妥钠溶液处死各组大鼠。通过RNA提取试剂盒提取腰段脊髓L5背角总RNA，以2 μg RNA为上样量，按照试剂盒说明书步骤在20 μL反应体系中对RNA进行反转录反应生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪对所选目标基因进行PCR扩增，引物序列如表1所示。实时荧光定量PCR的反应体系：cDNA模板1.6 μL，上、下引物(浓度为10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，最后使用去离子水将反应体系补充至20.0 μL。具体反应条件：95 ℃变性处理3 min，95 ℃、60 ℃各30 s，循环40次后，进行55 ℃退火处理15 s。每种基因设置4个复孔，使用2-ΔΔCt对IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因的相对表达量进行半定量分析。

表1 本实验实时荧光定量PCR检测中所使用的引物序列

2 结 果

2.1全身正弦波交变电磁场干预对于T2DM大鼠随机血糖的影响 与对照组大鼠相比，T2DM组及T2DM+EMF组大鼠的随机血糖值在实验的第0、2、4、6、8周均明显升高(P<0.001)。T2DM+EMF组的随机血糖值在交变电磁场刺激的第0、2、4、6、8周与T2DM组大鼠相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠随机血糖的影响

2.2全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠足底机械痛阈值的影响 T2DM组大鼠的足底机械痛阈值在实验的第0、2、4、6、8周均明显低于对照组大鼠(P<0.001)。T2DM+EMF组大鼠在交变电磁场干预之前(第0周)的足底机械痛阈值与T2DM组大鼠相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但是，T2DM+EMF组大鼠在实验第2、4、6、8周的足底机械痛阈值均明显高于T2DM组大鼠(P<0.01)。T2DM+EMF组大鼠在实验第0、2、4、6周的足底机械痛阈值均明显低于对照组大鼠(P<0.05)，但是T2DM+EMF组与对照组大鼠的足底机械痛阈值在第8周差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠足底机械痛阈值的影响

2.3全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠足底热痛阈值的影响 T2DM组及T2DM+EMF组大鼠在第0、2、4、6、8周的足底热痛阈值均明显低于对照组(P<0.001)。T2DM+EMF组大鼠在第0周的足底热痛阈值与T2DM组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但T2DM+EMF组大鼠在实验第2、4、6、8周的足底热痛阈值均明显高于T2DM组(P<0.01)。见表4。

表4 全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠足底热痛阈值的影响

2.4全身正弦交变电磁场对T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表达的影响 T2DM组大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表达水平明显高于对照组(P<0.05)，而NGF基因的表达水平明显低于对照组大鼠(P<0.05)。T2DM+EMF组大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表达水平明显低于T2DM组大鼠(P<0.05)，而其脊髓NGF的基因表达水平明显高于T2DM组大鼠(P<0.05)。但是，对照组与T2DM+EMF组大鼠之间的脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 全身正弦波交变电磁场干预对T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表达的影响

3 讨 论

随着20世纪70年代Bassett首次应用电磁场成功治疗骨折与骨不连的延迟愈合，电磁场的非热生物学效应日益得到国内外研究学者的广泛关注。而被学者们所认可且广泛使用的电磁场治疗场包括脉冲电磁场、正弦波交变电磁场以及稳恒磁场。其中正弦波交变电磁场由于可以直接由市电直接转换得到，因此凭借其简单易得、所输出的电磁设备成本相对较低的优势，得到基础医学和临床医学研究人员的广泛关注。研究表明，正弦波交变电磁场对于促进皮肤损伤愈合、加速骨创伤修复、改善微循环以及抑制肿瘤生长等具有积极治疗效果[8-9,12-13]。近年来，一些研究也发现正弦波交变电磁场具有明显的消炎和镇痛效应[10-11]。但是，正弦波交变电磁场对于糖尿病引起的神经病理性疼痛的作用效果及机制，目前国内外鲜见系统的研究报道，而其对于发生率更高的T2DM所诱发的神经病理性疼痛则更具临床应用价值。

本研究使用高糖高脂饮食饲喂8周并结合以低剂量STZ腹腔注射的方式构建T2DM大鼠动物模型，该实验步骤与方法已被国内外学者们使用，并被证实能够成功诱导T2DM动物模型[14-15]。该动物模型也被认为是迄今最为经典的诱发型T2DM动物模型，被广泛用于T2DM及其并发症的动物实验研究[16]。本实验结果也发现，该方法所诱导的大鼠具有高血糖、肥胖、多饮、多食、多尿等特征，与临床T2DM患者的症状一致。更重要的是，本研究行为学检测结果揭示，T2DM组大鼠相比于对照组大鼠表现出足底机械痛阈值和热痛阈值明显降低，而这与临床T2DM神经病理性疼痛患者对于外部刺激疼痛承受能力降低的现象一致，提示糖尿病神经病理性疼痛模型构建成功。而经过全身正弦波交变电磁场暴露的大鼠，其足底机械痛阈值和热痛阈值在刺激的第2周起就明显高于无电磁辐照的T2DM大鼠，且这对疼痛阈值的改善随着治疗进程的推进则越为显著，本研究结果提示交变电磁辐照疗法对于T2DM神经病理性疼痛具有改善作用。

在T2DM神经病理性疼痛的发生、发展进程中，脊髓炎性反应发挥了至关重要的作用[17]。IL-1β、TNF-α和IL-6作为最常见的促炎因子，已被证实在T2DM神经病理性疼痛脊髓中具有明显的高表达特性[18]。也有研究发现，通过抑制脊髓中这些炎症因子的表达，能够明显改善糖尿病神经病理性疼痛症状[19]。本实验发现，高糖高脂饮食诱导的T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表达水平明显高于非糖尿病大鼠，这与先前的临床结果保持一致。有趣的是，本研究发现全身交变电磁场治疗8周后，T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表达水平均明显降低。本研究结果提示，交变电磁场辐照疗法具有明显的抑制脊髓神经炎症的作用效果。其次，NGF是一种具有重要神经保护作用的细胞因子，对于促进轴突的生长具有重要作用，而机体NGF表达的改变会诱发神经元的功能障碍和死亡[20]。有研究也发现外源性施加NGF对于改善神经病理性疼痛症状具有积极效果[21]。本研究发现T2DM组大鼠脊髓中NGF基因表达水平明显低于对照组大鼠，这与先前的研究结果保持一致[22]；当经过电磁场治疗8周后，T2DM脊髓中NGF基因表达水平明显增加，提示交变电磁场对于促进脊髓中神经营养因子的表达具有正向调控作用。

综上所述，全身性的正弦波交变电磁场辐照疗法能够明显改善高糖高脂饮食所诱导的T2DM大鼠神经病理性疼痛症状，而这一效应与其抑制脊髓神经炎症和促进神经生长因子表达有关。作为一种无创、经济、安全的物理治疗手段，全身性的正弦波交变电磁场有望成为临床治疗T2DM神经病理性疼痛这一棘手问题的有效途径。